Comment le modèle de fournisseur direct de Macy l'aide à concurrencer Amazon et eBay – Dropshipping comment ça marche

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Macy's retire une page du livre de jeu d'Amazon en laissant les marques tierces exécuter les commandes et les expédier directement aux clients.

Grâce à un programme qui dirige l'entreprise & # 39; vendeur directement & # 39; Macy's peut ajouter et modifier la sélection de produits en fonction de ce qu'il sait des clients. Depuis le déploiement de la fonctionnalité dans sa boutique e-commerce en avril, le nombre de produits disponibles a doublé. Bien que les marques puissent expédier directement aux clients, elles peuvent également leur envoyer plus de 650 magasins qui servent également de centres de livraison.

"Nous proposons à nos clients une gamme hautement technique localisée sur un marché spécifique, en utilisant nos données et analyses améliorées, nous sommes en mesure d'influencer efficacement la gamme jusqu'au niveau du magasin", a déclaré le PDG Jeff Gennette dans une entrevue avec des investisseurs mercredi. Macy's a attribué en partie sa croissance de 3,3% dans le même magasin au fournisseur direct, un tissu conjonctif qui permet le commerce électronique via son réseau de magasins, ainsi qu'une expérience d'achat mobile.

La société étend le programme pour attirer les acheteurs en ligne et attirer des clients dans les magasins. Un poste vacant récent pour un vice-président du vendeur direct a déclaré que le programme se développe rapidement et est une priorité absolue pour la stratégie de croissance des affaires de l'entreprise. Il a des accords avec des marchés externes de Walmart et J. Crew, mais en gardant les produits intégrés dans l'écosystème de Macy, le détaillant exerce un contrôle sur l'expérience de bout en bout du client.

"Il est logique que Macy & # 39; s en tant que marque ne puisse transporter que de nombreux SKU; ils veulent offrir le bon type de gamme de produits et ils n'ont pas à se soucier de l'entreposage et des achats, et ils peuvent manœuvrer la gamme de manière agile », explique Corey Pierson, cofondateur de Custora, une plateforme d'analyse marketing prédictive pour les détaillants en ligne.

En créant une sélection de produits basée sur l'historique des achats et les données géographiques, Macy's peut améliorer la relation directe avec les clients en les gardant au sein de sa plateforme au lieu de les envoyer vers d'autres marchés, a-t-il ajouté. Cela aidera également à générer du trafic vers les magasins grâce à la collecte en magasin, un différenciateur clé des joueurs en ligne uniquement.

L'amélioration de la gamme de produits Macy en ligne peut également entraîner un impact marketing pour Macy via la recherche.

«La recherche est un énorme canal d'acquisition; Cela peut aider à attirer plus d'acheteurs vers la vitrine numérique de Macy », a déclaré Andrew Lipsman, analyste du commerce électronique et de la vente au détail. "Si vous ne disposez pas d'une gamme étendue, vous perdrez ces ventes à Amazon et eBay."

Malgré la flexibilité et la gestion directement permises par les fournisseurs, les grands détaillants doivent toujours faire preuve de prudence lorsqu'ils externalisent des commandes de tiers. En permettant aux fournisseurs de jouer un rôle dans la relation client, il y a un risque que le client s'adresse directement à eux plutôt que par l'intermédiaire du détaillant, a déclaré Griffin Carlborg, associé principal de recherche chez Gartner L2. De plus, si le fournisseur n'est pas en mesure de respecter les normes d'expédition et de service, la crédibilité du détaillant peut en souffrir.

"Cela peut poser un risque si le fournisseur livre des articles numériquement et expédie directement aux clients – les fournisseurs sont responsables de la qualité du produit expédié", a-t-il déclaré. "Il s'agit de normes, les règles et les relations [Macy & # 39; s] se développent avec les fournisseurs pour garantir qu'ils maintiennent l'intégrité de l'expérience client."

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How Macy’s ‘vendor direct’ model helps it compete against Amazon and eBay


Comment fonctionne le dropshipping ? Avec le dropshipping, les produits vont directement du fournisseur à vos clients. Vous ne gérez ni le stock, ni l'envoi des commandes.

Livraison de petits ARN interférents RIPK4 pour le traitement du cancer de la vessie à l'aide de nanotubes halloysite naturels – formations Copytrading

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Résumé

La technologie d'interférence ARN (ARNi) peut spécifiquement réduire l'expression d'un gène cible et s'est avérée être une méthode thérapeutique prometteuse pour le traitement du cancer. Dans la présente étude, nous avons montré que l'halloysite naturelle soutenait la délivrance de nanotubes (HNT) d'un petit ARN interférent (siRNA) actif ciblant la protéine kinase 4 interagissant avec les récepteurs (RIPK4) a réduit efficacement son expression pour traiter le cancer de la vessie. Le complexe HNTs / siRNA a augmenté la stabilité sérique des siRNA, prolongé la durée de vie de la circulation sanguine et favorisé l'absorption cellulaire et l'accumulation de tumeurs des siRNA. L'ARNsi est clairement régulé à la baisse RIPK4 expression dans les cellules cancéreuses de la vessie et les tumeurs de la vessie, inhibant la tumorigenèse et la progression dans trois modèles de tumeurs de la vessie (un modèle sous-cutané, un modèle de tumeur de la vessie in situ et un modèle de métastase pulmonaire), sans effets indésirables. Par exemple, nous avons dévoilé une méthode simple mais efficace pour inhiber l'utilisation du cancer de la vessie RIPK4 réduire au silence, indiquant une méthode thérapeutique prometteuse pour le cancer de la vessie.

INTRODUCTION

La thérapie génique ciblée a retenu davantage l'attention de la recherche pour l'éradication des tumeurs. Les petits ARN interférents (siRNA) ont montré un potentiel comme approche moléculaire pour réguler à la baisse l'expression génique spécifique dans les cellules cancéreuses (1, 2). Pour inhiber les gènes qui inhibent la prolifération, inhibent l'apoptose ou préviennent la résistance multirésistante, l'ARNsi délivré avec des nanosupports est devenu un nouveau centre d'intérêt pour la thérapie anticancéreuse (3). L'administration de siRNA à des cellules et tissus tumoraux spécifiques est nécessaire pour atténuer les effets hors cible qui pourraient nuire à l'indice thérapeutique et à l'application clinique de siRNA (4). La lutte contre le cancer à l'aide de supports de médicaments à nanoparticules implique généralement l'optimisation des propriétés biophysiques du support pour améliorer la perméation non spécifique et augmenter l'accumulation de tumeurs (5). Cela se fait généralement par le ciblage biochimique des récepteurs de surface surexprimés spécifiques aux cellules cancéreuses (6). Par exemple, dans une étude de phase 1 chez l'homme, un silençage génique sûr a été signalé chez des patients atteints de mélanome en utilisant le ciblage moléculaire médié par des nanoparticules de cellules cancéreuses qui surexpriment le récepteur de la transferrine (7). Au cours de la dernière décennie, l'accouchement par l'ARNsi s'est généralisé; cependant, le manque de véhicules d'administration in vivo efficaces, en particulier pour l'administration systémique dans les cellules immunitaires, reste un défi majeur pour la traduction de l'ARNsi en thérapeutique (8, 9). Cependant, des nanoparticules de véhicules de livraison de siRNA ont été récemment développées qui sont très puissantes, spécifiques et biocompatibles (1012). Cependant, il reste difficile de développer des nanosystèmes cliniques pour délivrer sélectivement l'ARNsi à la fois dans les cellules immunitaires et cancéreuses.13).

Des matériaux tels que les lipides, les polymères, les dendrimères, les micelles polymériques et les nanoparticules à noyau métallique ont été construits pour délivrer efficacement l'ARNsi (9, 14, 15). Nanotubes naturels d'halloysite (diamètre externe du HNT, 50 à 70 nm; diamètre lumenal, 10 à 15 nm; et longueur, 1 à 1,5 μm), qui sont souvent utilisés comme vecteurs non viraux pour transférer des agents actifs dans la capture et la libération ont montré des avantages dans les industries médicales et chimiques. L'utilisation de HNT pour les molécules d'acide nucléique pourrait résoudre les problèmes d'utilisation inefficace, de dégradation facile et d'effets secondaires toxiques des siRNA. Les activités de recherche se concentrent sur la taille correcte, la construction intelligente de la lumière, le couplage simple des modifications de surface et l'amélioration de la biocompatibilité (1618).

Par conséquent, dans la présente étude, nous avons utilisé des HNT pour délivrer un ARNsi anticancéreux thérapeutique qui cible activement l'oncogène RIPK4 (protéine kinase 4 interagissant avec les récepteurs), une sérine / thréonine kinase de la famille des RIP kinases avec un poids moléculaire apparent de 91,6 kDa. RIPK4 surexprime dans les cancers cutanés, ovariens, cervicaux et colorectaux (19, 20). Nous l'avons montré plus tôt RIPK4 est fortement exprimé dans les tissus cancéreux de la vessie et représente un marqueur pronostique indépendant pour une mauvaise survie (21). De plus, des effets anti-tumoraux clairs ont été observés par la suite RIPK4 renversement du cancer de la vessie (21).

Dans la présente étude, des nanoclusters HNT ont été développés pour fournir efficacement un ciblage siRNA RIPK4 (RIPK4 siRNA) pour être silencieux RIPK4 expression dans le cancer de la vessie, dans le but d'inhiber la tumorigenèse du cancer de la vessie. Les résultats ont montré que l'ARNsi encapsulé HNT était plus stable dans le sérum, avait une durée de vie plus longue dans le sang, était plus facilement absorbé par les cellules cancéreuses de la vessie et accumulé dans les tumeurs cancéreuses de la vessie. Le complexe HNTs / siRNA précipite RIPK4 expression clairement dans les cellules cancéreuses de la vessie, ce qui a supprimé efficacement la tumorigenèse et la progression du cancer de la vessie. Ainsi, le système d'administration à médiation par nanoparticules développé dans la présente étude est une méthode simple et efficace pour inhiber la tumorigenèse du cancer de la vessie en tant que thérapie potentielle, non identifiée auparavant, du cancer de la vessie.

RÉSULTATS

Synthèse et caractérisation des HNT

La figure 1A montre la morphologie régulière et l'homogénéité de la taille du halloysite dans la plage ~ 500 nm, préparée par la combinaison d'une homogénéisation à cisaillement rapide et d'une centrifugation à viscosité uniforme en deux étapes (figure 1A). Les nanoparticules dans la gamme de 500 nm devraient être des candidats appropriés comme porteurs pour livrer l'ARNsi dans les cellules, selon des études antérieures (22, 23). Un halloysite surdimensionné ou sous-dimensionné ne serait probablement pas absorbé par les cellules et présenterait une charge siRNA inefficace. Les extrémités des nanotubes étaient débloquées et la lumière des nanotubes était visible. SiRNA chargé négativement (en raison du groupe phosphate (PO43−)) a été absorbé dans la lumière chargée positivement de l'halloysite (grâce au groupe aluminol (Al-OH)) en utilisant des méthodes d'imprégnation sous vide (figure 1B). Après imprégnation sous vide, la plupart des HNT ont été remplis de siRNA. La livraison en fonction du temps de l'ARNsi a eu lieu dans des conditions neutres (figure 1C). Le point isoélectrique était d'environ 6,5 (figure 1D) et le potentiel zêta variait de 13,8 mV (pH 2,0) à -29,0 mV (pH 12,0). La forme chargée dépendante du pH bénéficiera de la libération contrôlée des siRNA et améliorera leur résistance à la dégradation.

figure 1 Caractérisation des HNT chargés en siRNA.

(UNE) Images de microscopie électronique à transmission de HNT & HNT & # 39; s / siRNA. (BDiagramme schématique des HNT combinés avec l'ARNsi. (C) Libération cumulative de siARN de HNT / siARN dans des conditions neutres. (DPotentiel zêta de HNT & # 39; s et Al2O.3.

Efficacité de liaison aux siRNA et cytotoxicité des HNT

L'efficacité de la liaison de l'ARNsi a été déterminée en utilisant des essais de déplacement de mobilité électrophorétique dans des gels d'agarose. Le rapport des HNT aux siRNA variait de 1: 1 à 100: 1. La figure S1A montre que la mobilité des siRNA à travers le gel diminuait à mesure que de plus grandes quantités de HNT étaient utilisées. La bande siRNA n'a pas quitté le puits à un rapport de 50: 1, ce qui suggère que le rapport optimal des HNT sur siRNA était de 50: 1. La cytotoxicité des HNT a été évaluée en utilisant le test du bromure de 3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT). Les HNT ont été utilisés pour délivrer le siRNA témoin négatif (siNC) aux cellules T24 (déterminé à partir d'un carcinome urinaire humain de grade III très malin) pour déterminer leur cytotoxicité. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de complexes HNT & # 39; s / siNC. Comme le montre la Fig. S1 (B et C), à une concentration élevée de complexes HNT de 500 μg / ml, qui était 50 fois supérieure à la concentration requise pour une transfection hautement efficace, le complexe HNTs / siNC n'a pas affecté de manière significative la viabilité de les cellules. La lipofectamine 3000, en revanche, a montré une certaine cytotoxicité à la dose utilisée pour une transfection efficace selon le protocole du fabricant. Ces résultats ont montré qu'en raison de leur faible toxicité, les HNT pouvaient être utilisés comme vecteur de transfert d'ARNsi.

Enregistrement intracellulaire de HNT & # 39; s / siRNA

Pour étudier le comportement d'absorption intracellulaire des nanoparticules de HNT pour délivrer l'ARNsi dans les cellules cancéreuses, l'absorption des complexes FAM-siRNA de HNT par les cellules T24 a été examinée sous un microscope à fluorescence inversé avec de la fluorescéine (FAM) – étiqueté siRNA (FAM siRNA). La figure 2A montre qu'après 6 heures d'incubation, l'ARNsi FAM a été observé dans les cellules T24, indiquant que les HNT étaient internalisés. Pour déterminer précisément l'effet de la composition des formulations sur l'internalisation des siRNA, nous avons incubé des cellules T24 avec des siRNA HNT & # 39; s / FAM pendant 6 heures, puis utilisé la cytométrie en flux pour analyser les cellules après trempe. de la fluorescence extracellulaire avec du bleu trypan. La figure 2B montre que pour les complexes siRNA FAM du HNT, la proportion de cellules fluorescentes augmentait avec l'augmentation des doses de siRNA FAM. De plus, les cellules traitées avec les complexes siNNA HNTs / FAM à une dose de 200 nM ont montré une efficacité de transfection comparable à celle obtenue avec les complexes siRNA Lipofectamine 3000 / FAM. À 250 nM, la transfection n'a pas changé de manière significative. Par conséquent, nous avons décidé d'utiliser 200 nM siRNA comme dose optimale pour la transfection de HNT dans les cellules T24. L'utilisation de HNT a provoqué une toxicité similaire à celle de la Lipofectamine 3000 pendant la transfection de l'ARNsi.

Figure 2 L'efficacité de transfection et la distribution de siRIPK4 délivré par HNT dans les cellules cancéreuses de la vessie T24.

(UNE) Images de microscopie à fond clair et à fluorescence de la fluorescence HNT / FAM-siRIPK4 6 heures après la transfection. (BAnalyse par cytométrie en flux de cellules fluorescentes: histogrammes représentatifs (panneaux supérieurs) et moyennes ± écart-type (panneaux inférieurs, issus de trois expériences indépendantes). FAM-siRIPK4, siRNA marqué à la fluorescéine ciblant RIPK4. (C) Analyse par microscopie confocale à balayage laser de la distribution des HNT / FAM-siRIPK4 dans le cancer de la vessie T24. Fluorescéine (verte) – étiquetée siRIPK4. Le DAPI (4 & # 39;, 6-diamidino-2-phénylindole; bleu) a été utilisé pour colorer les noyaux cellulaires.

Distribution intracellulaire et échappement lysosomal du siRNA FAM

Pour parvenir à un silençage génique post-transcriptionnel cytoplasmique, il est essentiel d'échapper l'ARNsi des lysosomes après l'entrée dans les cellules (24). Pour déterminer si les siRNA délivrés par les nanoparticules étaient capables de sortir des endosomes et / ou des lysosomes, les cellules T24 ont été traitées avec des siRNA HNT & # 39; s / FAM pendant diverses périodes et les localisations cellulaires des nanoparticules ont été déterminées. Du DAPI (4 & # 39; 6-diamidino-2-phénylindole) a été utilisé pour colorer les noyaux cellulaires. Comme le montre la Fig. 2C, HNTs avec siRNA FAM (vert) ont été initialement distribués principalement dans la membrane cellulaire. Deux heures plus tard, la distribution efficace du code de l'ARNsi dans le cytoplasme a été démontrée par la distribution ponctuée dans le cytoplasme des cellules T24 et à la périphérie des noyaux de l'intensité de fluorescence de l'ARNsi FAM. De plus, l'intensité de fluorescence a été significativement augmentée après 4 et 8 heures. Les résultats suggèrent que les nanoparticules hybrides se trouvent dans les endosomes ou les lysosomes précoces immédiatement après la transfection. Après une incubation prolongée, le siRNA FAM a été libéré des lysosomes et a montré une intensité de fluorescence claire dans le cytoplasme. Par la suite, les cellules T24 ont été colorées avec LysoTracker et les cellules ont été surveillées par microscopie confocale pour étudier la fuite de HNT / siARN des lysosomes (Fig. S2). Après 1 heure d'incubation, la fluorescence verte (FAM-siRNA) et rouge (LysoTracker) dans les cellules T24 a été colocalisée (Fig. S2), indiquant que le siRNA marqué FAM ciblant RIPK4 (FAM-siRIPK4) est situé dans les lysosomes a été trouvé. Après 4 heures d'incubation, la fluorescence verte (FAM-siRIPK4) a été séparée de la fluorescence rouge (LysoTracker; Fig. S2), indiquant que le FAM-siRIPK4 s'était échappé des lysosomes du cytoplasme. Nous avons ensuite analysé quantitativement la colocalisation de siRIPK4 avec les lysosomes pendant le temps d'incubation (Fig. S3A), donnant des résultats cohérents avec les observations de la Fig. S2. De plus, le rapport de fuite de siRIPK4 des lysosomes est passé de 34 à 80,5% de 3 à 6 heures (Fig. S3B). Par conséquent, nous pensons que siRIPK4 intact s'est échappé des lysosomes dans le cytoplasme pour effectuer un silençage génique médié par siRNA.

Suppression du gène RIPK4 par les complexes HNTs / siRIPK4 dans les cellules T24

Le RIPK4 L'effet de knockdown des gènes des complexes HNTs / siRIPK4 a été mesuré dans les cellules T24. Comme le montre la Fig. S4, siRIPK4 a abaissé le niveau de la RIPK4 Dépendant de la dose d'ARNm. siRIPK4 à 100, 150 et 200 nM a entraîné des réductions de 57,4, 87,6 et 97,2% du RIPK4 Niveau d'ARNm par rapport à celui du groupe complexe HNTs / siNC, respectivement (P <0,001). Le groupe HNTs / complexes siNC n'a montré aucune réduction par rapport à celui du témoin. Comme prévu, le niveau de protéine RIPK4, tel qu'évalué par Western blot, a diminué en fonction de la dose (Fig. S4). Ces résultats ont montré que la transfection avec les complexes HNT & # 39; s / siRIPK4 supprimait efficacement l'expression de RIPK4 sur l'ARNm et la teneur en protéines dans les cellules T24.

Cycle cellulaire, apoptose et prolifération cellulaire après élimination du RIPK4

L'effet de RIPK4 knockdown par HNTs / siRIPK4 sur la prolifération des cellules T24 in vitro a été évaluée en utilisant le MTT et les tests de formation de colonies de plaques. La croissance et la formation de colonies de cellules T24 ont ensuite été considérablement réduites RIPK4 knockdown par rapport à celle du groupe HNTs / siNC complexes (P <0,001; figues. S5 et S6). En revanche, cette réduction n'a pas été observée dans le groupe complexe HNTs / siNC (figures S5 et S6). Ainsi, la prolifération des cellules T24 a été spécifiquement réduite par les complexes HNT & # 39; s / siRIPK4 en raison de l'expression in vivo de RIPK4. L'isothiocyanate de fluorescéine d'annexine V (FITC) et la coloration à l'iodure de propidium ont été utilisés pour déterminer l'effet des HNT / siRIPK4 sur l'apoptose des cellules T24. Comme le montre la Fig. S7, le siRIPK4 libéré par les HNT & # 39; s, a augmenté de manière significative le niveau d'apoptose par rapport à celui induit dans les cellules HNT & # 39; s / siNC (P <0,001). De plus, aucune apoptose n'a été induite par HNT & # 39; s / siNC (Fig. S7), démontrant que la régulation négative de RIPK4 a provoqué une apoptose. Dans les cellules T24 traitées avec différentes formulations, le cycle cellulaire a été examiné par cytométrie en flux. Comme le montre la Fig. Le traitement avec S8, HNTs / siRIPK4 a significativement réduit l'indice de prolifération par rapport à celui des groupes témoins. Ces résultats ont indiqué que l'appauvrissement de RIPK4 par HNTs / siRIPK4 inhibait la prolifération et provoquait l'apoptose et l'arrêt du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses T24.

Biodistribution in vivo par injection intratumorale

L'administration directe d'ARNsi thérapeutique dans le tissu cible (c'est-à-dire l'apport d'ARNsi localisé) a le potentiel de réduire les effets secondaires généralement provoqués par l'administration systémique. Une injection intratumorale directe de siRNA pour obtenir une administration locale a été rapportée dans plusieurs modèles de xénogreffes de souris. La polyéthylèneimine chargée de siRNA a inhibé la croissance tumorale après injection intratumorale chez des souris portant des xénogreffes de glioblastome (25). Pour prévenir la récurrence du cancer de la vessie superficielle postopératoire sans provoquer d'effets secondaires graves causés par l'administration systémique, l'instillation intravésicale de médicaments de chimiothérapie (par exemple, Calmette-Guerin, pirarubicine et gemcitabine) est l'option de traitement la plus largement acceptée. Par conséquent, les défis associés à l'administration systémique de siRNA peuvent être évités dans le cancer de la vessie. Pour évaluer si l'injection directe de tumeur dans un modèle de cancer de la vessie de souris pourrait atteindre une distribution uniforme de siRNA dans toute la tumeur, HNTs / siRIPK4 ont été injectés par voie intratumorale dans des xénogreffes sous-cutanées de souris. La distribution de FAM-siRIPK4 a été évaluée par imagerie in vivo. Des FAM-siRIPK4 nus, des HNT et une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ont été utilisés comme témoins. La figure 3A montre que 0,5 heure après l'injection de HNT & # 39; s / FAM-siRIPK4, une fluorescence plus intense a été observée sur le tissu tumoral par rapport à celle du groupe FAM-siRIPK4 nu. De manière cohérente, le groupe traité par HNT / FAM-siRIPK4 avait une région de fluorescence significativement plus grande que le groupe traité nu par FAM-siRIPK4. Cela suggère une excellente pénétration tissulaire des HNT portant FAM-siRIPK4 aux sites tumoraux et une distribution ultérieure sur une plus grande zone tumorale par rapport à celle du groupe FAM-siRIPK4 nu. 16 heures après l'injection, le groupe FAM-siRIPK4 du HNT présentait toujours une fluorescence au niveau du site tumoral, tandis qu'aucune fluorescence visible n'a été observée dans les groupes traités FAM-siRIPK4, HNT ou PBS nus. Dans les tissus tumoraux, nous avons émis l'hypothèse que le FAM-siRIPK4 rempli de HNT empêchait l'agrégation et l'adsorption protéique non spécifique des nanoparticules; ainsi, HNT & # 39; s / FAM-siRIPK4 est resté au site tumoral plus longtemps que le FAM-siRIPK4 nu.

Fig. 3 Transfection tumorale in vivo et inhibition de la croissance tumorale par les HNT / siRIPK4.

(UNE) Imagerie in vivo de souris porteuses de xénogreffes T24 après injection intratumorale de HNT & # 39; s / FAM-siRIPK4, de FAM-siRIPK4 libre, de HNT & # 39; s ou de PBS (n = 3 souris dans chaque groupe). (B) Imagerie in vivo de souris porteuses de xénogreffes T24 après injection de la veine caudale de HNT & # 39; s / FAM-siRIPK4, de FAM-siRIPK4 libre, de HNT & # 39; s ou de PBS (n = 3 souris dans chaque groupe). (C) Chronologie de l'évaluation des activités anti-tumorales des complexes HNT & # 39; s / siRIPK4 dans le modèle de xénogreffe sous-cutanée in vivo. (DImages des tumeurs disséquées de souris porteuses de tumeurs ayant reçu divers traitements (n = 5 souris dans chaque groupe). (E) Volume tumoral relatif chez des souris nues BALB / c avec des xénogreffes HNT / siRIPK4 au fil du temps. (F) Poids des tumeurs décomposées des souris après traitement. ***P <0,001.

Biodistribution in vivo via l'injection de veine caudale

Nous nous sommes demandé si le siRIPK4 revêtu de nanoparticules de HNT pouvait traverser la circulation sanguine pour atteindre les sites tumoraux et s'ils étaient stables en circulation. Les souris ont été injectées via la veine caudale avec du PBS, du FAM-siRIPK4 libre, du HNT & # 39; s ou du HNT & # 39; s / FAM-siRIPK4. La biodistribution des complexes chez la souris a été détectée par le système Xenogen IVIS Lumina après 6 heures d'injection. Comme le montre la figure 3B, le groupe injecté HNT & # 39; s / FAM-siRIPK4 a montré l'accumulation des complexes HNT & # 39; s / FAM-siRIPK4 dans le cœur, les poumons, le foie, les reins, la rate et, surtout, la tumeur, alors que seul le fond de fluorescence tumorale peut être observé dans le groupe injecté FAM-siRIPK4, ce qui suggère que l'ARNsi peut être rapidement éliminé in vivo par la circulation sanguine en l'absence de couches de nanoparticules. Nos données suggèrent que HNT's / FAM-siRIPK4 est stable en circulation et peut être efficacement administré aux sites tumoraux in vivo via l'injection de veine caudale.

Efficacité anti-tumorale

Par la suite, le knockdown du gène et les effets anti-tumoraux des complexes HNT & # 39; s / siRIPK4 ont été examinés dans trois modèles de tumeurs de la vessie, y compris un modèle sous-cutané, un modèle de tumeur de la vessie in situ et un modèle d'injection de veine caudale de métastases pulmonaires.

Effet anti-tumoral dans un modèle sous-cutané

L'effet de croissance anti-tumorale de HNT & # 39; s / siRIPK4 a été comparé à celui de siRIPK4 nu. Des souris athymiques avec des xénogreffes de cellules T24 ont été injectées par voie intratumorale avec HNT / siRIPK4 à 20 ug par injection une fois par semaine pour un total de cinq fois (figure 3C). Le traitement HNTs / siRIPK4 a supprimé le plus significativement la croissance tumorale parmi les traitements, tandis que la suppression de la croissance tumorale induite par siRIPK4 libre n'était pas significative par rapport à celle du groupe témoin (figure 3D). Les volumes tumoraux chez les souris traitées avec HNT / siRIPK4 ont été réduits de 77,4% par rapport à celui du groupe témoin (figure 3E). En revanche, le traitement gratuit avec siRIPK4 n'a eu aucun effet significatif sur la croissance tumorale (Fig. 3, D et E). Le poids tumoral dans le groupe HNTs / siRIPK4 était également le plus faible de tous les groupes (figure 3F). De plus, la suppression des niveaux de protéine RIPK4 n'a été observée que dans les xénogreffes HNT / siRIPK4, comme évalué par Western blot et immunohistochimie (IHC) (figures S9 et S10). L'IHC a ensuite été utilisé pour analyser l'expression du gène lié à la prolifération Ki-67 afin d'évaluer si la régulation négative de RIPK4 inhibait la prolifération des cellules tissulaires tumorales. Le traitement avec HNT / siRIPK4 a diminué les niveaux de la protéine Ki-67 (Fig. S11). Pour déterminer l'apoptose des cellules tumorales, on a utilisé le test de marquage terminal de la désoxyuridine triphosphate médié par la désoxynucléotidyl transférase (TUNEL). Les tumeurs traitées par HNT / siRIPK4 avaient un nombre significativement accru de cellules apoptotiques (Fig. S11). Par conséquent, l'administration de siRIPK4 via les HNT a spécifiquement inhibé la croissance des xénogreffes de cancer de la vessie.

Effet anti-tumoral dans un modèle de tumeur vésicale in situ

Pour tester la signification clinique des complexes HNTs / siRIPK4, l'effet de suppression tumorale des HNTs / siRIPK4 a été étudié dans un modèle de cancer de la vessie in situ, car la chimiothérapie de l'instillation vésicale est l'un des principaux traitements du cancer de la vessie. Le modèle de cancer de la vessie in situ chez le rat a été établi avec succès. Par la suite, les effets anti-tumoraux de HNT & # 39; s / siRIPK4, HNT & # 39; s, free siRIPK4 et PBS ont été déterminés. Le poids de la vessie de rat et le nombre de lésions de la vessie de rat différaient entre les groupes de traitement (tableau S1). Les différences observées dans le poids de la vessie et les changements histopathologiques entre les différents groupes de traitement étaient significatives (P < 0.05). After treatment with HNTs/siRIPK4, most of the bladder tumors were in a lower stage (stage pT1/Ta), while in the PBS control group, most of them were in higher tumor stages (>pT2). Cela suggère que l'effet thérapeutique du HNT & # 39; s / siRIPK4 était significativement meilleur par rapport à celui du PBS. Cette conclusion a été confirmée histologiquement dans les cloques excisées et dans les coupes de tissus colorés à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) (Fig. 4).

Fig.4 Le siRIPK4 in vivo libéré par HNT inhibe la promotion tumorale des cellules cancéreuses de la vessie T24 dans un modèle in situ de cancer de la vessie (n = 12 rats dans chaque groupe).

(UNEVessies excisées représentatives et coupes de tissus colorées H&E (cancer de la vessie invasif musculaire: ≥ stade pT2) traitées avec du PBS. (BVessies excisées représentatives et coupes de tissus colorées H&E (cancer de la vessie invasif musculaire: ≥ stade pT2) traitées avec siRIPK4. (CVessies excisées représentatives et coupes de tissus colorées par H&E (cancer de la vessie invasif musculaire: ≥ stade pT2) traitées avec HNT. (DVessies excisées représentatives et coupes de tissus colorés H&E (carcinome papillaire non invasif: stade pTa) traitées avec HNT's / siRIPK4. (Crédit photo: Jianye Liu et Ke Cao, The Third Xiangya Hospital of Central South University).

Effet anti-tumoral dans un modèle d'injection de veine caudale de métastases pulmonaires

Nous avons injecté les cellules T24 dans les veines caudales de souris nues BALB / c pour former des tumeurs pulmonaires métastatiques. Les nodules de métastases pulmonaires ont été comptés dans les poumons excisés de chaque groupe (figure 5A). Dans le groupe traité par HNTs / siRIPK4, la formation de métastases macroscopiques de tumeur pulmonaire a été presque complètement inversée, ce qui était en contraste avec les résultats pour le contrôle PBS et d'autres groupes. Comparé au groupe témoin PBS, aux groupes libres siRIPK4 et HNT, chez les souris traitées avec HNTs / siRIPK4, le nombre de nodules métastatiques pulmonaires a diminué de 77,8, 76,5 et 76,9%, respectivement. De plus, les résultats de la coloration H&E des coupes pulmonaires ont démontré l'effet suppressif supérieur des HNT & # 39; s / siRIPK4 sur la formation de foyers macro et micrométastatiques dans les poumons par rapport à celui des autres groupes (figure 5A). L'apparition d'une invasion tumorale et de métastases peut être améliorée par la croissance et la prolifération rapides des cellules tumorales (26); ainsi, le remarquable effet anti-tumoral du HNT & # 39; s / siRIPK4 pourrait expliquer la remarquable activité anti-métastatique. Ensemble, ces résultats ont démontré que les HNT / siRIPK4 in vivo présentaient une plus grande efficacité anti-tumorale et des effets anti-métastatiques que le siRIPK4 libre ou les autres traitements, suggérant l'application clinique potentielle de ce système d'administration à base de nanoparticules.

Fig. 5 In vivo, inhibe les métastases tumorales et la toxicité des HNT / siRIPK4 par injection de veine caudale des HNT / siRIPK4 (n = 5 souris dans chaque groupe).

(UNE) In vivo siRIPK4 libéré par HNT inhibe les métastases tumorales dans l'injection de veine caudale du modèle de métastases pulmonaires. N, poumon normal; M, tumeur pulmonaire métastatique. Des poumons séparés de souris recevant PBS, siRIPK4, HNT & # 39; s ou HNT & # 39; s / siRIPK4 ont été colorés avec H&E (à gauche). Évaluation quantitative des nodules pulmonaires métastatiques chez les souris porteuses de tumeurs T24 (à droite). **P <0,01. (BVingt-quatre heures après la dernière injection intraveineuse de PBS, siRIPK4, HNT & # 39; s et HNT & # 39; s / siRIPK4, coloration H&E de coupes de tissus pour analyse histopathologique.

Évaluation de la toxicité in vivo

Le système immunitaire inné des mammifères est vigoureusement activé par des duplex d'ARNs libres, conduisant à une inflammation systémique in vivo en raison de l'induction de niveaux élevés de cytokines inflammatoires (27). Cette réponse inflammatoire à l'ARNsi peut entraîner une toxicité in vivo importante. Nous avons utilisé les complexes HNT / siRIPK4 pour diminuer le niveau d'immunostimulation induite par siRIPK4 libre. Nous avons examiné la toxicité in vivo des complexes siRIPK4 à différentes doses. Les sections colorées H&E du foie, des poumons, du cœur, de la rate et des reins n'ont pas montré de changements histologiques marqués entre le groupe HNT / siRIPK4 et les autres groupes (figure 5B). Ainsi, les complexes HNT & # 39; s / siRIPK4 n'ont montré aucune toxicité apparente pour les organes. Les paramètres fonctionnels du foie et des reins étaient dans la plage normale dans le groupe HNTs / siRIPK4 (tableau S2). Cependant, des niveaux relativement élevés d'alanine aminotransférase (ALT) et d'aspartate aminotransférase (AST) ont été induits dans le groupe siRNA libre (tableau S2), indiquant que le siRNA libre a provoqué une insuffisance hépatique (28). De plus, les doses thérapeutiques de HNT & # 39; s / siRIPK4 n'ont pas provoqué de réponse immunitaire significative, car les taux sériques de cytokines, y compris l'interféron-α (IFN-α), l'interleukine-1β (IL-1β), l'IL-6 et le facteur de nécrose tumorale-α (TNF -α) étaient similaires à celles du groupe témoin (Fig. S12). En revanche, des niveaux relativement élevés d'IFN-α, IL-1β, IL-6 et TNF-α ont été induits dans le groupe siRNA libre (figure S12) (27). Ensemble, ces résultats ont indiqué que les complexes in vivo HNTs / siRIPK4 sont plus sûrs et moins toxiques que les siRNA libres.

Niveau d'expression de la voie du signal du facteur nucléaire KB dans les tissus tumoraux

Nous avons ensuite étudié la voie de signalisation en aval impliquée dans la régulation de RIPK4 de la tumorigenèse et de la progression des cellules cancéreuses. Dans plusieurs lignées cellulaires diffuses de grands lymphomes à cellules B, la régulation à la hausse du facteur nucléaire activé par RIPK4 KB (NF-KB), tandis que l'inactivation de RIPK4 a eu l'effet inverse (29). La surexpression de RIPK4 a systématiquement provoqué l'activation dose-dépendante de NF-κB dans les cellules 293T (30). Dans notre étude précédente, nous avons également vu que RIPK4 activait la voie NF-KB dans le cancer de la vessie (21). Par conséquent, nous avons utilisé des tests Western blot et IHC pour vérifier le mécanisme d'interférence ARN in vivo (ARNi) des complexes HNT & # 39; s / siRIPK4 après euthanasie des animaux. Les analyses par Western blot des niveaux de protéines liées à NF-κB dans chaque masse tumorale ont montré des réductions significatives chez les souris traitées avec HNT / siRIPK4 (Fig. S9). Cependant, chez les souris traitées avec des HNT déchargés ou du siRIPK4 libre, les niveaux de protéine NF-κB n'ont pas montré de diminution significative par rapport à ceux du contrôle PBS. Des changements similaires à ceux observés par Western blot ont été observés dans la coloration immunohistochimique des tissus tumoraux sous-cutanés (Fig. S10). Ainsi, la régulation par RIPK4 de la prolifération et de la progression du cancer de la vessie peut impliquer la signalisation NF-κB comme voie en aval.

DISCUSSION

Dans la présente étude, nous avons construit un complexe de silençage génique à base de siRNA appelé HNT & # 39; s / siRIPK4 pour inhiber efficacement la prolifération et la progression du cancer de la vessie en abaissant les niveaux de RIPK4. HNTs / siRIPK4 à régulation négative RIPK4 expression avec succès via la voie du complexe de silençage induit par siRNA / RNA (Fig. 6). L'analyse du mécanisme induit par l'ARNi in vivo a montré que la voie de signalisation NF-κB pourrait être la voie de signalisation en aval impliquée dans la régulation de la prolifération et de la progression du cancer de la vessie par RIPK4.

Fig. 6 Fourniture de complexes HNT & # 39; s / siRIPK4 pour RIPK4 l'inhibition et le traitement du cancer de la vessie.

Le complexe HNTs / siRIPK4 le protège RIPK4 siARN de dégradation sérique par les nucléases et la clairance rénale, et favorise RIPK4 accumulation de siRNA dans les cellules tumorales, ce qui le fait taire RIPK4 dans les tumeurs de la vessie. Sous-régulé RIPK4 l'expression inhibe la prolifération et la progression du cancer de la vessie.

Le silençage génique a été proposé comme traitement des maladies humaines, l'ARNsi étant le mécanisme de silençage le plus prometteur. Cependant, la livraison intracellulaire de siRNA aux tissus et organes spécifiques exprimant le gène cible est le plus grand défi pour leur utilisation chez l'homme (7). Deux considérations pratiques doivent être prises en compte: le siRNA lui-même (stabilité et spécificité) et le système d'administration (31). Dans la circulation sanguine, les nucléases sériques dégradent l'ARN nu, ce qui peut entraîner une stimulation du système immunitaire inné (32). In de huidige studie toonden we aan dat op HNT gebaseerde levering van siRNA hun serumstabiliteit verhoogde en hun off-target effecten verminderde terwijl ze hun zwijgende vermogen handhaafden. De toepassing van HNT&#39;s om nucleïnezuurmoleculen af ​​te leveren, zou de problemen van inefficiënt gebruik, gemakkelijke afbraak en toxische bijwerkingen kunnen oplossen (16).

Afleveringsproblemen belemmeren echter nog steeds de productie van veilige, robuuste en efficiënte op siRNA gebaseerde behandelingen (33). Ondanks hun kleine formaat wordt de doorvoer van siRNA over het celmembraan belemmerd door hun negatieve lading en hydrofiliciteit. Bovendien wordt siRNA snel uit de bloedsomloop verwijderd voordat het het aangetaste weefsel bereikt (34, 35). Modificaties en afgiftesystemen voor siRNA kunnen dus beoogde effecten (gerichte gene silencing) en onbedoelde effecten hebben, zoals immuunstimulatie, toxiciteit en off-target silencing (35). Voor levering in vivo zijn veel materialen onderzocht, waaronder lipiden, antilichamen van polymeren, peptiden, aptameren en kleine moleculen.

Om de bijwerkingen van conventionele niet-gerichte chemo- en kleine RNA-therapeutica te minimaliseren, stelden we de hypothese dat de fysiochemische eigenschappen van alleen de materialen selectieve levering aan specifieke cellen zouden kunnen verlenen. We identificeerden selectieve HNT&#39;s die efficiënt blaaskankercellen in vitro en in vivo transfecteerden. We hebben aangetoond dat ze kunnen worden gebruikt om kankercelspecifieke medicijndragers te ontwikkelen. De huidige studie heeft de haalbaarheid van deze aanpak vastgesteld om de doelactiviteit van geneesmiddelen te verhogen. Het toonde ook aan dat HNT-dragers celtype-afhankelijke levering vertonen.

We toonden aan dat HNT&#39;s siRNA efficiënt en specifiek in blaaskankercellen konden afleveren om gerichte genuitschakeling te bereiken. RIPK4 gen-selectieve knockdown door HNT&#39;s / siRIPK4 remde in vitro en in vivo blaaskankergroei en -progressie door proliferatie te remmen en apoptose te induceren. De efficiëntie van siRNA-opname en gen-knockdown met behulp van fusie-eiwitcomplexen kan worden beïnvloed door de affiniteit van het antilichaam, de variaties in de dichtheid van de receptor op het celoppervlak, de efficiëntie van internalisatie van de receptor en endocytose, en hun daaropvolgende afgifte door endosomen. Verder onderzoek is nodig om de mechanismen te bepalen die de afgifte van het gecomplexeerde siRNA uit de endosomen regelen, hun intrede in het cytoplasma en de cellulaire locatie van door RNA geïnduceerde silencing-complexvorming en -activiteit, die cruciale knelpunten zijn voor intracellulaire aflevering (33). Over het algemeen worden liposomen en polymere deeltjes in de vroege fase van klinische studies voor de systemische afgifte van antikanker siRNA in de lever vastgehouden of uitgescheiden door nierfiltratie en concentreren ze zich dus niet in tumoren (35). By contrast, in vivo, siRIPK4 delivered by HNTs was targeted to, and accumulated in, the tumors. We hypothesized that the diameters of the siRIPK4 and HNT particles were small enough such that the complex can cross the hepatic sinusoidal endothelium and glomerular filtration barrier to access the malignant tissue.

The innate immune system expresses many pattern recognition receptors, like Toll-like receptors 3, 7, and 8 (TLR3, TLR7, and TLR8, respectively), double-stranded RNA (dsRNA)–dependent protein kinase (PKR), and the RNA helicase protein retinoic acid-inducible gene 1 protein (RIG-I), which recognize different aspects of RNA structure, and thus may affect siRNA delivery (36). siRNA-induced immune activation may cause transient increases in cytokine levels between 1 and 24 hours after siRNA administration (37). However, no marked changes in cytokines were detected at any time point after treatment, which contrasted with the increased IFN-α and IL-6 levels observed at 6 hours after the injection siRNA delivered via polyconjugates (38). The results of the present study showed that the antitumor activities of HNTs/siRIPK4 are not the result of siRNA-mediated nonspecific activation of the innate immune response. In addition, no treatment-related or dose-dependent toxicities of HNTs/siRIPK4s were observed, and they were very well tolerated.

Our results showed that HNTs/siRIPK4s have marked potential to treat bladder cancer; however, some challenges must be resolved before their clinical application. First, the purification process should be improved to eliminate potential contaminants, such as endotoxins. Second, optimization of the active targeting antibody, siRNA, and dosing regimen is required in rodents and nonhuman primates. Third, the trafficking pathway allowing the siRNA to exit the endosomes and enter the cytoplasm should be determined. These optimization and mechanistic studies should increase the antitumor activity of the HNTs/siRIPK4. The significance of the present study lies in the selective delivery of siRIPK4 to bladder tumors. Our previous finding that most of the bladder cancer cases express RIPK4 (21) indicated the therapeutic potential of targeting RIPK4. The results demonstrate the potential of siRNA to treat patients with bladder cancer.

In the present study, biocompatible HNTs were developed as a delivery platform for siRNA (HNTs/siRNA complex) to target RIPK4 for bladder cancer treatment via RIPK4 depletion. The HNTs/siRNA complex not only provides protection against the harsh biological environment but also passively targets tumor tissues. The HNTs/siRNA complex enhanced the specific in vitro and in vivo knockdown of RIPK4 in bladder cancer cells and bladder tumors, which effectively suppressed tumor growth and progression in three bladder tumor models with no adverse effects or toxicity. HNT-assisted delivery of siRNA targeting RIPK4 holds promise as a therapeutic approach to treat bladder cancer.

MATERIALS AND METHODS

Materials, siRNA, and cell lines

Tumor cell line T24 (human bladder cells; American Type Culture Collection) was grown in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM; CellGro) with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) (CellGro) in 5% CO2 at 37°C. The oligoribonucleotide sequence of the siNC and human RIPK4 siRNA (siRIPK4) were as follows: 5′-GACACCAGCAAACUGAUGATT-3′ (sense) and 5′-UCAUCAGUUUGCUGGUGUCCC-3′ (antisense) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Shanghai, China). Fluorescein-tagged siRNA (FAM-siRNA) was synthesized using fluorescein modification of the 3′-end of the sense strand. Mouse antibodies recognizing RIPK4 and β-actin were obtained from Abcam (Cambridge, UK). Rabbit antibodies recognizing marker of proliferation Ki-67 (Ki-67), inhibitor of NF-κB (IκB) kinase subunit β (IKK), phospho (p)–IKK, IκB, p-IκB, and NF-κB p65 subunit (NF-κB-p65) antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Denver, MA, USA).

HNTs/siRNA preparation and characterization

HNT aqueous solution preparation: 1.0 g of halloysite ore was processed for 90 s using high-speed crushing, 400-mesh sieving, 25-min ultrasound, and differential centrifugation (5 min at 3000 rpm and 10 min at 9000 rpm), and then centrifuged for 5 min at 10,000 rpm. The microstructure of the HNTs was characterized using scanning electron microscopy (TESCAN MIRA3 LMU), transmission electron microscopy (JEOL JEM-200CX), x-ray diffraction (DX-2700), and Fourier transform infrared spectra (Nexus 670).

siRNA loading: 30 μl of HNT aqueous solution (3 mg/ml) was mixed with 12 μl of siRNA solution (1 OD unit of siRNA was dispersed into 125 μl of DEPC (diethyl pyrocarbonate) water), vacuum impregnated for 3 hours, and then centrifuged for 5 min at 10,000 rpm. The siRNA loading efficiency was evaluated by gel electrophoresis of the supernatant.

Gel electrophoresis

Agarose gel electrophoresis (1%) was used to assess complex formation between HNTs and siRNA, using mass ratios of HNTs to siRNAs of 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, and 1:1. The resulting HNTs/siRNA complexes were left for 30 min to form complexes at room temperature, after which the samples were subjected to centrifugation at 5000 rpm for 5 min. The suspensions were reserved for analysis. The pellets were electrophoresed through 1% agarose gels and with ethidium bromide (0.1 μg/ml) at 100 V for 40 min in tris-acetate (TAE) buffer (0.045 M TAE; 0.001 M EDTA); the bands were visualized on an ultraviolet transilluminator.

In vitro transfection and the distribution of HNTs/FAM-siRIPK4

Briefly, in 24-well plates, trypsinized cells were seeded (n = 3) at 5 × 104 cells per well and incubated overnight until they reached 60 to 80% confluence, after which they were transfected with various formulations. FAM-siRNA uptake by the cells was assessed after 6 hours using an inverted fluorescence microscope (Olympus, IX71, Japan). In addition, cells were trypsinized, centrifuged (2000g, 3 min), resuspended in PBS, and analyzed using flow cytometry (Beckman Coulter).

Next, T24 cells were seeded in a 35-mm glass-bottom culture dish (MatTek Corp.) at 5 × 104 cells per well and incubated at 37°C in 5% CO2 for 24 hours. The cell culture medium was then substituted by HNTs/FAM-siRIPK4 complexes in 500 μl of serum-free DMEM in each well. At various time points, the cell culture medium was removed, and the cells were washed three times with PBS. DAPI (Sigma-Aldrich) was then used to stain the nuclei for 5 min. The cells were directly observed using confocal laser scanning microscopy with an Olympus FLUOVIEW confocal microscope and analyzed using the FV10-ASW viewer software (Olympus, Tokyo, Japan).

Lysosomal escape of siRNA

To study the escape of the siRNAs from lysosomes, T24 cells (1 × 105 cells per well) were seeded into a confocal dish and incubated for 24 hours. LysoTracker Red (75 nM, 1 hour, Invitrogen) was then used to stain the T24 cells. Thereafter, HNTs/FAM-siRNA and free FAM-siRNA (200 nM FAM-siRNA equivalent) were incubated with the T24 cells at 37°C for 1 hour. The cells were then rinsed and incubated in fresh medium for 1 to 6 hours. Samples were taken at different time points, the cells were fixed using 4% paraformaldehyde (PFA), and observed using confocal microscopy. LysoTracker Red and FAM-siRNA were detected at excitation wavelengths of 550 and 480 nm, respectively.

RIPK4 expression analysis

Only HNTs/siRIPK4 (100, 150, or 200 nM siRIPK4 at a mass ratio of 50:1), HNTs, HNTs/siNC (200 nM siNC), or PBS was used to transfect T24 cells (5 × 104) in 24-well plates (n = 3). RNA and proteins were harvested from the cells after 24 or 48 hours.

TRIzol reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was used to isolate total RNA, and a PrimeScript RT Reagent Kit (Promega, Madison, WI, USA) was used to synthesize cDNA. An ABI 7900HT fast real-time polymerase chain reaction (PCR) system (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) was used to perform real-time quantitative PCR (qPCR). The reaction comprised 30 cycles of 30 s at 94°C, 30 s at 55°C, and 60 s at 72°C. The qPCR primers for RIPK4 et ACTB (encoding β-actin) were as follows: RIPK4-specific primer, 5′-GCCCACTACCACGTCAAGAT-3′ (forward) and 5′-TTCACCATGATGTGCAGGAT-3′ (reverse); β-actin–specific primer, 5′-CATTAAGGAGAAGCTGTGCT-3′ (forward) and 5′-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA-3′ (reverse). SDS–polyacrylamide gel electrophoresis was used to resolve equal amounts of whole-cell lysates. The separated proteins were transferred electrophoretically onto a polyvinylidene difluoride membrane (Pall Corp., Port Washington, NY). Western blotting analysis was then carried out using standard protocols.

MTT assay

The T24 cells were plated in 96-well plates at 3000 cells per well in 100 μl of DMEM supplemented with 10% FBS. HNTs (10, 50, 100, 250, and 500 μg/ml) carrying 50 nM siNC, or Lipofectamine 3000 conjugated with the same amount siNC, or the siNC only, or PBS control was used to treat the cells for 6 hours. The cell culture medium was replaced with fresh medium, and the cells were incubated for another 72 hours. Following the addition of 20 μl of MTT reagent (5 mg/ml) to each well and incubation for 4 hours, the medium was replaced with 200 μl of dimethylsulfoxide (Sigma, St. Louis, MO, USA). The absorbance was then measured using a microplate reader at a wavelength of 490 nm.

Measurement of LDH in culture media by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Cells grown in 10-cm dishes were treated at the indicated time as described in the figure legends. The culture media were collected, and the concentration of lactate dehydrogenase (LDH) was determined with an LDH ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kit (Abcam) according to the manufacturer’s protocols.

Colony formation assays

After treatment with the indicated formulations for 48 hours, T24 cells in six-well plates (1 × 103 cells per well) were cultured for 10 to 14 days. After a clone had formed, the cells were washed twice using PBS, fixed with PFA, and stained using crystal violet.

Apoptosis analysis using flow cytometry

T24 cells were plated at a density of 3 × 105 per well in six-well plates. Forty-eight hours later, various formulations were added to the medium. Thereafter, an Annexin V–FITC Apoptosis Detection Kit (Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan) was used to assess the apoptosis rate according to the manufacturer’s protocol.

Cell cycle assays

For cell cycle analysis, T24 cells were plated at a density of 5 × 104 cells per well in 24-well plates. At 48 hours after transfection with HNTs/siRIPK4, HNTs/siNC, unloaded HNTs, or PBS, cells in each well were trypsinized, fixed with 70% ethanol, and then stained using a Coulter DNA-Prep Reagents Kit (Beckman Coulter, Fullerton, CA). Flow cytometry was then used to detect the DNA content in the cells of each sample (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

In vivo fluorescence imaging

We purchased female BALB/c-nu/nu athymic mice (4 to 5 weeks old) from the Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. (Shanghai, China). The Institute Research Medical Ethics Committee of The Third Xiangya Hospital of Central South University approved the animal care and experimental protocols used in this study.

T24 cells (4 × 107) in 100 μl of PBS were injected subcutaneously to grow tumors. When the tumors developed, the mice were randomly assigned to four treatment groups (n = 3 mice), which were injected intratumorally or via the tail intravenously with 400 μl of HNTs/FAM-siRIPK4, or an equal dose of free FAM-siRIPK4, HNTs only, or PBS solution, respectively. The mice were placed onto a prewarmed stage inside an IVIS light-tight chamber after intratumoral injection. The mice were kept under anesthesia using 2.5% isoflurane. The Xenogen IVIS Lumina system (Caliper Life Sciences, USA) was used to acquire images, and Living Image 3.1 software (Caliper Life Sciences) was used to analyze the results. For in vivo distribution of the complex, mice were euthanized 6 hours after tail intravenous injection. The heart, lung, liver, kidney, spleen, and tumor tissues were harvested and analyzed by the Xenogen IVIS Lumina system and Living Image 3.1 software.

In vivo antitumor activity in a model of subcutaneous bladder cancer

T24 cells were allowed to form a monolayer, after which trypsin digestion was used for form a single-cell suspension. The cell density was adjusted to 4 × 107 in 100 μl of PBS and then subcutaneously injected into the right flank of each mouse. Once the T24 cells developed a tumor (tumor volume about 100 mm3), the mice were randomly assigned to four treatment groups (n = 5 mice in each group). The tumors of the mice in each group were injected directly with HNTs/siRIPK4 (20 μg of siRIPK4 per injection, 50:1 mass ratio) or an equal amount of unloaded HNTs, siRIPK4 only, or PBS, respectively. The injections were repeated once a week for 5 weeks. The long and short axial lengths of the tumors were measured every other day. The tumor xenografts were harvested, weighed, and snap frozen for cryosectioning or formalin fixed for paraffin sectioning. H&E was used to stain the histological sections of the tumors. Tumor apoptosis was examined histologically using the TUNEL assay on primary tumor sections using a Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit (Beyotime, Haimen, China) according to the manufacturer’s protocol. A Dako Real Envision Kit (K5007, Dako) was then used for immunohistochemical staining with primary antibodies to detect the protein levels.

In vivo antitumor activity in a model of in situ bladder cancer

Female Sprague-Dawley rats (aged 6 to 7 weeks; 120 to 150 g) were purchased from Shanghai Slac Laboratory Animal Co. Ltd. Ether inhalation was used to anesthetize the rats. N-methyl-nitrosurea solution (0.2 ml at 10 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO, USA) was used to infuse the rat bladders via a 22-gauge angiocatheter every other week for five times. The animals remained anesthetized for approximately 45 min after catheterization to avoid spontaneous micturition (39).

Tumors were successfully induced at 16 weeks. Thereafter, 48 rats were assigned to four groups with 12 rats in each group. From the 16th week, and after anesthetizing the rats, their bladders were instilled with 500 μl of HNTs/siRIPK4, an equal dose of free HNTs, siRIPK4 only, or PBS solution. After instillation, the animals were kept under anesthesia for about 45 min to avoid spontaneous micturition. The treatments were repeated once a week for 5 weeks. Two days after the end of therapy, the animals were euthanized. Their bladders were removed, weighed, fixed in 4% PFA for 24 hours, embedded in paraffin, and analyzed histopathologically. Transverse sections were cut through the midportion of the bladder and subjected to H&E staining.

In vivo antitumor activity in a lung metastasis model

BALB/c nude mice were divided randomly into three groups (n = 5 per group) and treated through the tail vein with bladder cancer cells (2.5 × 106) that had been treated with HNTs/siRIPK4, an equal dose of free HNTs, siRIPK4 only, or PBS solution every 7 days for five times, respectively. Fort-eight hours after cessation of therapy, the animals were euthanized. The mouse lungs were excised, photographed, and examined histologically. In each lung, the numbers of macroscopic metastatic nodules were counted.

Toxicity assay in mice

At 24 hours after the final intravenous injection, the major organs (heart, liver, spleen, lungs, and kidney) of the mice were excised, fixed, sectioned, and stained with H&E for histological analysis. The tissue slices were subjected to microscopic observation (Leica DMI 6000B). Before organ collection, an electronic balance was used to determine the body weights of the mice. At 24 hours after the final intravenous injection, blood was sampled from the venous plexus of the mice’s eyes. The blood samples were subjected to immediate centrifugation at 3000g for 5 min at 4°C. Hematological analysis was then performed on the supernatant. The blood biochemical analysis comprised determining the ALT, AST, blood urea nitrogen, and creatinine levels using Modular Analytics (Roche, Germany). ALT and AST were used as indicators of hepatic functions, and blood urea nitrogen and creatinine were used as indicators of renal functions. To assess the immunotoxicity of the various formulations, we determined cytokines present in the serum using ELISA kits for IL-1β, IL-6, IFN-α, and TNF-α (Abcam).

Statistical analysis

Data are presented as means ± SD. For comparisons between two groups, the unpaired Student’s t test (two tailed) was used. For multiple group analysis, one-way analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni tests was used. Statistical significance was considered at a P value less than 0.05.

SUPPLEMENTARY MATERIALS

Supplementary material for this article is available at http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/5/9/eaaw6499/DC1

Fig. S1. Efficiency and cytotoxicity of the siRNA binding to HNTs.

Fig. S2. Lysosomal escape of HNTs/siRIPK4 in T24 bladder cancer cells.

Fig. S3. Intracellular trafficking and lysosomal escape of HNTs/siRIPK4.

Fig. S4. qRT-PCR of RIPK4 mRNA and Western blotting analysis of the RIPK4 protein in T24 cells after HNTs/siRIPK4 transfection.

Fig. S5. HNTs/siRIPK4 inhibited the growth of T24 cells in vitro by MTT assay and LDH assay.

Fig. S6. HNTs/siRIPK4 inhibited the growth of T24 cells in vitro (colony formation).

Fig. S7. Annexin V and propidium iodide staining of T24 cells treated with HNTs/siRIPK4 complexes and other formulations, and analysis of apoptosis using flow cytometry.

Fig. S8. After HNT-mediated RIPK4 knockdown in T24 cells, FACS was used to analyze the cell cycle.

Fig. S9. Tumor tissues analyzed using Western blotting from the subcutaneous xenograft model.

Fig. S10. Tumor tissues analyzed using IHC from the subcutaneous xenograft model.

Fig. S11. HNTs/siRIPK4 reduced Ki-67 expression and induced apoptosis of mice bearing T24 xenografts.

Fig. S12. Immunotoxicity analysis of blood of mice at 24 hours after PBS, siRIPK4, HNTs, and HNTs/siRIPK4 injection.

Table S1. Tumor suppression effect of different treatment on bladder weight and histopathologic changes in SD rat bladders of different groups.

Table S2. Biochemical parameters of blood from the mice at 24 h after last injection of various drugs.

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is not for commercial advantage and provided the original work is properly cited.

Acknowledgments: We thank the Hunan Key Laboratory of Pharmacodynamics and Safety Evaluation of New Drugs for performing the animal experiment. Funding: This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81802556 and 81874137), the Natural Science Foundation of Hunan Province (2019JJ30039), the New Xiangya Talent Projects of The Third Xiangya Hospital of Central South University (JY201615), and the Scientific Projects of Health and Family Planning Commission of Hunan Province (B2017034). Author contributions: K.C. and J.L. designed the experiments. J.L., Y.Z., Q.Z., H.Z., H.X., and H.B. performed the experiments. J.L., XY.L., L.H., Z.L., and M.X. analyzed the data. K.C., J.L., YX.Z., Q.Z., P.W., XM.L., and Y.Z. wrote the paper. All the authors discussed the results and commented on the manuscript. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.

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Il existe de légères différences entre le trading de copie et le trading miroir. La définition du trading glace reflète une stratégie de trading. Les traders imitent le modèle de trading ou les stratégies de trading des autres traders. Au départ, les opérateur étaient intéressés par des algorithmes particuliers qui ont été développés et les développeurs ont partagé leur réel de trading. Les opérateur trouveraient des algorithmes à fort rendement, alors copieraient leurs résultats, demandant aux développeurs s’ils pouvaient suivre stratégies. Le trading de copie est né du trading miroir. Avec le trading de copie, on ne reçoit pas la disposition de la stratégie du copieur. Au lieu de cela, ils suivent aveuglément les métiers du trader.

Vous avez perdu un emploi? Une entreprise fermée? Êtes-vous incapable de payer une hypothèque? L'aide est là – N°1 sur l’Affiliation

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Si vous avez perdu votre emploi pendant la pandémie de COVID-19, si vous êtes propriétaire d'une petite entreprise forcée de fermer ou si vous avez du mal à effectuer vos paiements hypothécaires ou par carte de crédit, de l'aide est disponible.

Cependant, il peut être difficile de déterminer à quels programmes vous êtes éligible et comment les ouvrir. Voici quelques suggestions d'experts du New Jersey. Peu importe le type de soulagement que vous recherchez, soyez patient. L'infrastructure pour fournir des avantages est serrée.


Vous, votre argent, votre travail: Le jeudi 9 avril à 19 h 00, le New Jersey 101.5 organise une discussion en direct sur la survie de l'économie des coronavirus et l'obtention de l'aide dont vous avez besoin. Branchez-vous sur New Jersey 101.5 FM, écoutez dans l'application New Jersey 101.5 ou regardez et rejoignez-nous sur Facebook en direct sur Facebook.com/NJ1015.


Chômage:

Tous les bureaux de chômage personnels sont fermés dans le New Jersey jusqu'à nouvel ordre. La seule façon de demander un avantage est d'appeler ou de se connecter en ligne. Aucune de ces options ne serait comme "rapide" & # 39; sont considérés. En raison du nombre record de demandes, le New Jersey est également limité à certains jours en fonction de votre numéro de sécurité sociale. Cliquez ici pour savoir quand vous appelez ou postulez en ligne.

Le New Jersey emploie et forme plus de personnel d'autres départements, mais attendez-vous à de longues attentes lorsque vous appelez. Lorsque vous soumettez une demande en ligne, l'infrastructure informatique est vieille de plusieurs décennies et sujette aux pannes et aux plantages en raison du grand nombre de réclamations. L'État a récemment fait appel à des programmeurs informatiques qui connaissent COBOL pour maintenir cette infrastructure obsolète opérationnelle.

Ceux qui sont admissibles aux allocations de chômage dans le New Jersey peuvent également être éligibles à une allocation supplémentaire de 600 $ par semaine en vertu de la législation signée par le président Donald Trump.

Consultez ce manuel pour demander une allocation de chômage par téléphone.

Cliquez ici pour archiver en ligne.

Que vous soyez en ligne ou par téléphone, plusieurs questions vous seront posées. Les principaux sont:

• Étiez-vous capable et disponible de travailler?
• Cherchiez-vous activement du travail?

Répondez "OUI" aux deux. De nombreux déposants disent "NON" en raison de la commande du New Jersey à domicile, ce qui a retardé le traitement des demandes.

Sur le site Web du ministère du Travail du New Jersey:

Question 1 – Étiez-vous capable et disponible pour travailler?

La réponse à cette question doit être OUI si:

1. Vous étiez physiquement en mesure de faire votre travail avant de perdre votre emploi (et vous avez perdu votre emploi / vos heures en raison de votre propre maladie coronavirus, de votre besoin de prendre soin d'un membre de votre famille / ménage atteint de coronavirus, ou votre situation de travail a changé en raison du coronavirus urgence de santé publique); OU

2. Vous êtes temporairement sans emploi en raison d'une fermeture d'employeur en raison du coronavirus et vous comptez retourner à votre emploi; OU

3. Vous êtes capable et disponible pour travailler.

Question 2 – Cherchiez-vous activement du travail?

Si vous attendez d'être rappelé à votre emploi actuel ou si vous retardez votre recherche d'emploi jusqu'à la fin ou la disparition de cette urgence naturelle, vous devez répondre OUI.

Aide aux petites entreprises:

En raison de la législation récemment adoptée aux niveaux national et fédéral, il existe une variété de programmes d'aide directe et de prêts pour aider les petites entreprises.

La New Jersey Economic Development Authority coordonne bon nombre de ces programmes, y compris des prêts à faible coût pour couvrir les frais d'exploitation et (dans certains cas) la masse salariale.

Les candidatures sont accessibles via le site NJEDA, mais le traitement des candidatures ne commence que le lundi 13 avril 2020.

Selon le site Web de la NJEDA, «Le programme de prêt d'aide d'urgence aux petites entreprises est conçu pour fournir un prêt direct allant jusqu'à 100 000 $ aux petites entreprises et aux organismes sans but lucratif du New Jersey».

D'autres formes d'éclairage sont proposées, notamment:

• Le programme de protection des chèques de paie – conçu pour encourager les entreprises locales à garder les employés sur la liste de paie

• Prêts pour dommages causés par une catastrophe économique – similaires aux prêts offerts après la tempête de sable pour couvrir les pertes catastrophiques

La NJEDA offre plus de détails et d'assistance pour la soumission des candidatures ici:

Allégement hypothécaire et carte de crédit:

Le gouverneur Phil Murphy a annoncé un accord avec plusieurs grands prêteurs nationaux et banques à charte d'État pour accorder aux résidents du New Jersey une prolongation de 90 jours de leur paiement hypothécaire.

Il est important de noter qu'il ne s'agit pas d'une remise de prêt. Dans la plupart des cas, les paiements sont crédités à la fin du terme. Cependant, vous n'êtes pas tenu de payer des intérêts supplémentaires ou des amendes si vous êtes admissible.

Ce soulagement n'est pas non plus automatique. Vous devriez appeler votre prêteur et, dans la plupart des cas, remplir une demande. Vous devez fournir des documents sur les difficultés économiques et les prêteurs peuvent rejeter votre demande.

Le New Jersey n'a pas conclu un large accord similaire avec les banques sur l'éclairage des cartes de crédit, mais la New Jersey Bankers Association affirme que de nombreuses sociétés de cartes de crédit offrent une forme de réparation. Si vous avez du mal à effectuer un paiement, ils recommandent d'appeler directement la société émettrice de la carte de crédit et de plaider votre cause.

Le Département des banques et des assurances du New Jersey propose les conseils suivants sur son site Web:

Comment obtenir un allégement hypothécaire et / ou un paiement différé?

Vous devrez contacter et travailler directement avec votre prêteur hypothécaire pour en savoir plus et demander l'aide disponible. Gardez à l'esprit que les institutions financières et leurs agents reçoivent beaucoup de questions.

Combien de temps dure la tolérance?

Les conditions d'un montant fixe sont convenues entre vous et votre service hypothécaire. Les institutions financières confirment l'approbation et les conditions du programme de tolérance.

Quel effet cela a-t-il sur mon dossier de crédit?

Les institutions financières ne signalent pas d'informations dérogatoires (par exemple, les retards de paiement) aux agences d'évaluation du crédit, mais peuvent signaler un report, ce qui n'a généralement pas seulement un impact négatif sur un pointage de crédit.

Combien de temps durent ces programmes?

On ignore encore la gravité ou la durée des effets du COVID-19. Les institutions financières se sont engagées à fournir les secours nécessaires et évalueront les conditions actuelles et la nécessité de poursuivre les secours.

Que faire si mon institution financière n'offre pas cet allégement?

Actuellement, Citigroup, JP Morgan Chase, US Bank, Wells Fargo et Bank of America, en plus de plus de 40 autres banques fédérales et à charte d'État, coopératives de crédit et gestionnaires, soutiennent ces obligations. L'État accueille toutes les autres institutions qui souhaitent répondre à l'instant et fournir une aide financière très nécessaire aux New Jerseyans.

Que se passe-t-il si j'ai déjà effectué un paiement ou si j'ai reçu une compensation en raison de COVID-19?

Ces mesures entreront en vigueur le 28 mars 2020.

Un allégement hypothécaire est-il offert aux entreprises?

L'allégement n'est actuellement disponible que pour les hypothèques résidentielles.

Que faire si mon prêteur hypothécaire n'est pas communicatif ou coopératif?

Vous pouvez déposer une plainte auprès du service bancaire et des assurances via le formulaire de plainte ou en contactant le service au (609) 292-7272 ou 1-800-446-7467 (de 9 h 00 à 17 h 00 HNE). du lundi au vendredi).

LIRE LA SUITE: Découvrez 50 emplois à distance qui peuvent bien payer



Comment promouvoir des articles Amazon sur votre blog ou bien site ? Une que vous avez trouvé articles à fournir à votre audience, il vous reste à mettre en avant sur votre site. C’est une étape essentielle pour optimiser vos ventes en affiliation et propulseur vos revenues. Amazon rêve manières de mettre en ses produits sur votre blog ainsi qu’à votre blog ou votre site par contre vous allez voir que certaines sont clairement à éviter ! Pour chacun possibilité, le résultat sera du code HTML que vous avez plus qu’à copier dans vos articles pour les afficher.

Comment créer un site Web d'affiliation rentable à l'aide de WordPress – Tout sur l’Affiliation

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Voulez-vous créer un site Web d'affiliation rentable? Ou avez-vous déjà un site Web affilié que vous souhaitez optimiser pour augmenter vos revenus? Le marketing d'affiliation est l'un des meilleurs moyens de gagner de l'argent en ligne. Avec la bonne stratégie, vous pouvez optimiser votre site Web afin qu'il attire le bon trafic, ce qui génère à son tour plus de revenus pour vos clients.

Dans cet article, nous vous montrons comment créer un site Web d'affiliation rentable avec WordPress.

Qu'est-ce que le marketing d'affiliation?

Le marketing d'affiliation consiste à choisir un produit que vous aimez, à le promouvoir en ligne et à toucher des commissions lorsque quelqu'un l'achète via vos filleuls. Le marketing d'affiliation est l'un des moyens les plus fiables de gagner de l'argent en ligne pour les éditeurs.

Mais avant de pouvoir commencer à gagner un revenu grâce aux commissions affiliées, vous devez avoir un suivi en ligne important afin de pouvoir promouvoir les produits avec eux. Le moyen le plus simple de créer un fichier d'abonné et de gagner de l'argent en faisant la promotion de produits d'affiliation est de créer votre propre site Web d'affiliation.

Avant de discuter de la façon dont vous pouvez commencer avec le marketing d'affiliation, examinons rapidement la création d'un site Web d'affiliation avec WordPress.

Comment créer un site Web affilié à l'aide de WordPress

Bien qu'il existe de nombreux constructeurs de sites Web gratuits qui vous permettent de démarrer rapidement un site Web, il est toujours préférable d'investir de l'argent dans la configuration de votre site Web, surtout si vous souhaitez gagner de l'argent avec le marketing d'affiliation.

Pour la plupart des utilisateurs, un site WordPress.org auto-hébergé est la solution parfaite car il vous donne un contrôle complet sur votre site Web, même si vous n'êtes pas techniquement qualifié. Il est également livré avec de nombreux modèles et modules complémentaires à choisir, de sorte que vous pouvez créer tout type de site Web que vous pouvez imaginer.

Mieux encore, vous n'avez pas besoin d'un gros budget pour créer un site Web WordPress qui génère des revenus substantiels. Lorsque vous démarrez, vous n'avez qu'à payer pour enregistrer un nom de domaine et un plan d'hébergement WordPress pour héberger votre site.

Un nom de domaine est l'adresse de votre site Web. Vos utilisateurs saisissent ce nom dans leur navigateur pour accéder à votre site (par exemple, monsterinsights.com ou google.com).

L'hébergement de sites Web est la maison de votre site Web sur Internet. Vos fichiers de contenu et de site Web sont stockés ici.

Un nom de domaine coûte généralement 14,99 $ / an et les coûts d'hébergement commencent à 7,99 $ / mois. Si vous recherchez l'hébergement WordPress parfait pour votre site, nous vous recommandons de choisir Bluehost. En plus d'offrir un service de haute qualité à des prix abordables, Bluehost est officiellement recommandé par WordPress comme l'un de leurs fournisseurs d'hébergement préférés.

En fait, Bluehost a accepté d'offrir à nos utilisateurs un nom de domaine gratuit et plus de 60% de réduction sur l'hébergement Web.

Bluehost Meilleur hébergement WordPress

Maintenant, vous pouvez obtenir un hébergement WordPress pour seulement 2,75 $ par mois plus un domaine gratuit.

Pour un guide détaillé étape par étape, vous pouvez lire comment créer un site Web WordPress.

Comment démarrer le marketing d'affiliation dans WordPress

Pour commencer avec le marketing d'affiliation, vous devez choisir un sujet de niche pour votre site, choisir des produits basés sur la niche et commencer à créer du contenu sur votre site pour le promouvoir.

Le moyen le plus simple de trouver un produit que vous souhaitez promouvoir est de rejoindre un programme partenaire comme Amazon Associates, Commission Junction ou ShareASale et de parcourir leur site.

Après avoir sélectionné un produit, vous pouvez obtenir un lien partenaire et promouvoir le produit via ce lien sur votre site.

Au fur et à mesure que vous vous développez en tant que distributeur affilié, vous utiliserez probablement le même lien d'affiliation sur des tonnes de blogs différents. C'est pourquoi la gestion et l'organisation de vos liens d'affiliation dans WordPress sont essentielles. Si vous utilisez un plug-in pour gérer les liens partenaires tels que ThirstyAffiliates, vous pouvez organiser tous vos liens partenaires en un seul endroit, afin de les trouver et de les remplacer ne pose aucun problème.

plugin de liens d'affiliation wordpress

Par exemple, si l'entreprise dont vous faites la promotion modifie son lien partenaire, vous n'avez pas besoin de fouiller profondément dans chaque article de blog que vous avez publié pour rechercher et remplacer les liens partenaires que vous avez ajoutés. Au lieu de cela, vous pouvez changer cela dans le panneau ThistyAffiliates et tous les liens connectés sur votre site seront mis à jour automatiquement.

Mis à part la gestion des liens, le plug-in vous permet de masquer vos liens connectés, afin que vous puissiez transformer vos liens connectés laids en de beaux liens.

Les liens affiliés sont généralement des URL longues et laides, comme celles-ci:

http://example.com/products/?product_id=123&affiliate_id

ThirstyAffiliates vous aide à masquer ces liens d'affiliation pour les rendre courts et les URL de marque ci-dessous:

http://www.yoursite.com/refer/productname

URL masquéeAffiliés assoiffés

Vous pouvez désormais utiliser les URL affiliées camouflées n'importe où sur votre site. Il est facile d'ajouter des liens d'affiliation avec ce plug-in.

Pour des instructions détaillées, lisez notre guide étape par étape pour ajouter des liens d'affiliation dans WordPress.

Comment gagner des revenus d'affiliation en attirant le bon public

Le fait que vous ayez créé un site et commencé à promouvoir des produits sur ce site ne signifie pas que vous gagnerez immédiatement des commissions d'affiliation. Pour générer des ventes d'affiliation sur votre site, assurez-vous d'attirer le bon public qui souhaite réellement lire les avis et recommandations sur votre site avant d'acheter les produits que vous promouvez.

Comment pouvez-vous déterminer si votre site Web attire le bon trafic et les intentions des visiteurs de votre site?

Si la plupart de votre trafic provient des moteurs de recherche, vous pouvez examiner l'intention des mots clés pour déterminer si vous attirez le bon trafic.

En général, il existe 4 types d'intentions de mots clés:

  • La navigation, où les utilisateurs recherchent un site Web spécifique.
  • Informatif, où les utilisateurs recherchent la réponse à une question.
  • Enquête, où les utilisateurs recherchent des informations qui peuvent finalement conduire à une transaction.
  • Transaction, où les utilisateurs sont prêts à acheter.

En tant que distributeur affilié, vous souhaitez classer votre site Web pour les mots clés de recherche. Vos prospects potentiels utilisent des mots clés de recherche lorsqu'ils essaient de comparer des produits et de rechercher des avis et des recommandations.

Certaines des phrases que vous verrez souvent dans les mots clés de recherche sont:

  • le meilleur
  • revue
  • comparaison
  • alternative

Pour trouver les recherches réelles utilisées par vos visiteurs organiques, vous pouvez accéder à votre rapport de requête dans Google Analytics en accédant à Acquisition »Search Console» Recherches.

trouver pour quels mots clés votre site e-commerce est optimisé

Si vous souhaitez en savoir plus sur le choix des bons mots clés, vous pouvez consulter le guide de recherche de mots clés d'OptinMonster.

Comment optimiser votre site de marketing d'affiliation pour encourager les commissions

Maintenant que vous avez commencé à attirer le bon groupe cible et, espérons-le, vous avez gagné des revenus d'affiliation, la prochaine chose sur laquelle vous devriez vous concentrer est d'optimiser votre site d'affiliation pour augmenter vos revenus d'affiliation.

Pour augmenter vos revenus, vous devez commencer par suivre vos liens liés dans Google Analytics. En suivant les liens d'affiliation, vous pouvez découvrir:

  • Sources de trafic les plus rentables: Une fois que vous avez compris vos sources de trafic les plus rentables, vous pouvez vous concentrer sur la promotion de votre contenu là où vous obtenez le meilleur retour sur investissement.
  • Pages générant le plus de revenus: Déterminez les pages avec le plus de conversions sur votre site afin de pouvoir les optimiser pour gagner encore plus d'argent.
  • Options de contenu: Proposez de nouvelles options de contenu pour gagner plus de revenus d'affiliation.

Le moyen le plus simple de suivre les liens d'affiliation est d'utiliser MonsterInsights sur votre site. C'est le meilleur plug-in Google Analytics pour WordPress et vous permet de tirer pleinement parti du suivi Analytics, notamment en suivant les liens d'affiliation, en suivant le commerce électronique, en suivant les publicités et plus encore.

Voici quelques avantages de l'utilisation de MonsterInsights pour optimiser les sites partenaires:

  • Vous pouvez identifier les liens internes qui sont des liens d'affiliation dans Google Analytics.
  • Vous pouvez facilement cliquer sur vos liens d'affiliation à partir d'autres clics, vous donnant un rapport de performance précis sur la façon dont vos visiteurs interagissent avec vos liens d'affiliation dans Google Analytics.
  • Google Analytics peut identifier la page d'où provient le clic.

Avec MonsterInsights, vous pouvez cliquer sur le suivi des partenaires en tant qu'événements dans Google Analytics.

En savoir plus sur la configuration du suivi des liens d'affiliation dans Google Analytics.

Une fois l'installation terminée, vous pouvez afficher votre rapport avec des liens connexes en accédant à Perspectives »Rapports» Éditeurs via votre tableau de bord.

Liens d'affiliation-Suivi-MonsterInsights

Dans ce rapport, vous trouverez vos 10 principaux liens connectés avec le nombre total de clics pour chaque lien.

Pour afficher les performances de tous vos liens connectés, cliquez sur Voir tous les rapports sur les liens d'affiliation au bas du rapport. Cliquez dessus pour accéder au rapport de marketing d'affiliation de votre compte Google Analytics.

rapport avec liens liés

Vous pouvez également trouver les meilleurs événements et pages, juste en dessous du Les événements onglet.

Voilà!

Nous espérons que ce guide vous a fourni des informations précieuses sur la création d'un site Web d'affiliation rentable avec WordPress. Si vous générez également des revenus avec votre blog AdSense, vous pouvez apprendre à optimiser vos annonces avec Google Analytics.

Et n'oubliez pas de nous suivre Twitter et Facebook pour plus de didacticiels sur Google Analytics.



L’affiliation commerce électronique est une technique de marchéage /distribution rémunérée à la performance qui est formel à Internet. Il est question du principe dont un site marchand et pourquoi pas à vocation commerciale mission à un réseau de sites ou d’individus (sites éditoriaux, comparateurs, influenceurs, …) de promouvoir ses articles et pourquoi pas ses solutions parmi le biais de bandeaux ou de amour textes pouvant être là sur des pages web ainsi qu’à des proclamation sociales. Selon cas, les affiliés sont rémunérés pendant une commission sur ventes, ou en fonction des allées et venues ainsi qu’à palpation commerciaux (leads) générés à partir de leur liens d’affiliation. Le programme d’affiliation d’Amazon compte par contre plus de 500 000 websites affiliés. Selon le CPA, le marché de france de l’affiliation (commissions versées) s’élevait à 177 poids d’€ pour l’année 2020.

Comment gagner de l'argent avec l'aide Forex – formations Copytrading

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Qu'est-ce que le Forex Trading?

Financièrement, le marché du Forex est le même que tout autre marché, par exemple comme une marchandise ou une action. La seule différence réside dans les biens, les actifs, les produits et les méthodes de transaction qui y sont vendus.

Le Forex est un marché où les devises nationales de différents pays sont échangées. L'objectif principal du trading est d'acheter la devise le moins cher possible et de la revendre le plus cher possible. Vous pouvez également faire le contraire: en supposant que le taux d'une devise baisse, vous la vendez aussi chère que possible, puis l'achetez moins cher. La différence de prix serait votre profit.

Pour commencer à trader sur le marché Forex, vous devez vous inscrire à RoboMarkets, configurer le bon type de compte de trading et choisir le terminal de trading où vous avez l'intention de trader. Nous proposons à nos clients différents types de comptes, afin que chaque trader, quelle que soit son expérience de trading, puisse trouver le meilleur choix pour répondre à toutes ses exigences et besoins. Pour ceux qui commencent tout juste à apprendre à trader sur le Forex, nous vous recommandons de créer un compte démo pour vous aider à vous entraîner et à tester vos compétences en premier. Ce n'est qu'alors qu'il peut être judicieux de passer au trading en argent réel. Pour les revendeurs débutants, un bon choix serait de créer un Demo Pro ou un vrai compte Pro-Cent.

Comment nos clients négocient le forex

Pour de nombreuses personnes qui sont nouvelles sur le marché des changes, il est difficile de comprendre ce qu'est le trading Forex et comment cela se fait. L'exemple suivant tente d'expliquer la procédure.

Par exemple, vous avez créé un compte commercial avec 500 $ et souhaitez effectuer des transactions sur l'EURUSD. Vous décidez ensuite de vendre ou d'acheter l'instrument de votre choix. Vous pensez que les quotas pour cette paire de devises chuteront à partir du 3 octobre, vous vendez donc 2000 $ au prix actuel de 1,1480 $ pour 1000 $, dans une transaction de 2000 $ * 111480 = 2850 $. Cette transaction est possible en raison de la valeur de l'effet de levier avec lequel vous pouvez exécuter des transactions qui sont plusieurs fois supérieures à la valeur des fonds de votre compte de trading.

Le 29 octobre, le taux atteint 111360 et vous achetez le même 2000 $ à un prix inférieur de 2000 $ * 111360 = 2821 $. Par conséquent, lorsque vous achetez 2 000 $, vous dépensez moins que de les vendre, et la différence (2 296 $ – 2 272 $ = 24 $) est votre profit. Les prix de performance ne sont pas ajoutés aux calculs, mais doivent également être pris en compte. La position est détenue pour la journée et n'est pas soumise à des frais de rover (swap).

Veuillez noter que la situation ci-dessus est utilisée comme exemple. Agir avec de l'argent réel peut entraîner des pertes.

Dans la plupart des cas, les informations complexes sont mieux comprises lorsqu'elles sont présentées via des visuels, nous vous proposons donc comment vous pouvez échanger sur le Forex grâce à nos didacticiels vidéo, qui seront sans aucun doute précieux pour les traders débutants.

La formation vidéo est destinée aux débutants

MetaTrader4 est l'un des programmes les plus populaires que les traders choisissent de trader. Vous pouvez télécharger le terminal sur votre ordinateur via notre Centre de téléchargement ou exécuter une version en ligne et commencer à vendre maintenant.

Télécharger MetaTrader4

Pour comprendre comment vous pouvez négocier efficacement le Forex, vous devez savoir comment analyser les marchés financiers. Nous proposons des revues analytiques dans l'industrie pour vous aider à acquérir de l'expérience et à apprendre à faire des prévisions précises.

Analyse Forex



Le commerce de copie est un phénomène moderne qui est changé la nature de l’industrie du commerce. Découvrez ce qui est, comment il s’est fort et pourquoi il est si important sur les marchés cryptographiques d’aujourd’hui. Faire des erreurs fait partie de la vie, et avec ces erreurs provient le désir de ne des fois répéter. Le premier plan d’action pour pousser à partir de ces erreurs est la leçon de vie durable de apprentissage. On en dire autant des réussites; apprendre d’eux pour que vous aussi puissiez découvrir des réalisations similaires. Dans le monde financier, il existe un concept qui s’articule autour de cet philosophie. C’est une astuce populaire sur le marché marchand qui conduit couramment à des avantages pour ceux qui l’appliquent. Cette méthode est appelée «copie de commerce». Cet étude expliquera ce que c’est, sa mécanique et ce qui le distingue des autres méthodes de trading.

Comment gagner de l'argent avec l'aide de programmes partenaires – N°1 sur l’Affiliation

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Quand j'ai commencé mon premier blog en ligne, je n'avais vraiment pas l'intention d'en faire de l'argent. J'ai commencé à écrire mon premier blog juste parce que j'aimais ça. Cependant, j'ai commencé à apprendre combien d'argent peut réellement être gagné en ligne, puis j'ai commencé à apprendre sérieusement à le réaliser. La plus grande aubaine dans mon entreprise est d'apprendre à gagner de l'argent en utilisant des programmes d'affiliation.

Dans ce guide, j'espère atteindre un objectif principal – Je te veux dans ma tête.

D'accord, attends. Cela semblait un peu étrange. Laissez-moi réessayer …

Bref, je veux que vous compreniez mon façon de penser. Bien sûr, c'est un peu un "manuel", mais plus important encore, je veux que vous compreniez vraiment comment je pense et pourquoi j'ai bâti mon entreprise comme je l'ai fait. Si vous pouvez voir les choses de mon point de vue, le monde mystérieux du marketing d'affiliation s'ouvrira pour vous. Je n'ai pas d'actions spécifiques à suivre, mais si je peux vous donner une idée générale du fonctionnement de cette entreprise et de la façon dont vous pouvez réussir, vous vous portez mieux.

Gagnez de l'argent avec le marketing d'affiliation

Le marketing d'affiliation n'est pas pour tout le monde!

Avant d'entrer dans le vif du sujet, je ne dis pas qu'apprendre à gagner de l'argent avec des programmes partenaires est nécessairement la meilleure voie pour vous. De tous ceux qui lisent ceci, seul un petit pourcentage devrait vraiment consacrer son temps et son énergie à l'apprentissage du marketing d'affiliation. Il existe des compétences et des tâches très spécifiques que vous devez effectuer quotidiennement pour votre entreprise. Si vous n'avez pas les compétences requises ou si vous n'êtes pas satisfait des tâches quotidiennes requises pour soutenir une entreprise de marketing d'affiliation réussie, ce n'est pas pour vous.

Non, je n'essaie pas de vous motiver en faisant ici une sorte de psychologie inversée. Ce que je vous dis c'est si vous pensez que le marketing d'affiliation n'est PAS pour vous après avoir lu ce guide, c'est bien! Il y a une autre route pour vous! Ne forcez pas le succès. Si ce que je mentionne ci-dessous semble être quelque chose que vous apprécierez, au moins mettez votre cœur et votre âme dedans.

Ce que je ne promettrai jamais sur ce site, c'est que le marketing d'affiliation peut conduire à une sorte de style de vie millionnaire rapide et riche. Certaines personnes gagnent en effet des millions avec le marketing d'affiliation. Je gagne 5 chiffres par mois (6 chiffres par an), donc je ne suis pas trop pauvre, mais cela m'a coûté une année pour grandir. Comme toute autre entreprise, les stratégies que je vais planifier pour vous prendront du temps à réaliser. Combien de temps? Consultez cet article pour une réponse super honnête.

Pourquoi j'aime le marketing d'affiliation

Maintenant que je viens de dire que le marketing d'affiliation n'est pas pour tout le monde, je veux expliquer pourquoi le marketing d'affiliation est ce que j'aime et pourquoi je ne voudrais pas diriger un autre type d'entreprise. Bien sûr, il existe de nombreuses façons de gagner de l'argent en ligne, mais le marketing d'affiliation offre des avantages fous, comme l'industrie de la publicité n'a jamais vu auparavant.


  • Aucune création ou maintenance d'un produit / service: Créer votre propre produit ou service à vendre est franchement une douleur dans le cul. Il faut beaucoup de temps, d'argent, d'investissements et de compétences pour s'assurer que tout se passe bien. Allez-vous fabriquer vous-même un produit physique? Avez-vous l'argent pour que quelqu'un d'autre fasse des choses pour vous? Ou peut-être que vous vendez un produit numérique tel qu'un livre électronique. Savez-vous comment vous pouvez mettre ce livre électronique sur le marché pour vraiment obtenir un public et gagner de l'argent avec lui? Rien de tout cela n'est un problème avec le marketing d'affiliation. Le produit ou le service que vous souhaitez promouvoir a déjà été créé, maintenu et tout est géré pour vous. La seule chose à laquelle vous devriez faire attention est de le commercialiser.

  • Risque essentiellement nul: L'un des meilleurs aspects de l'apprentissage de la façon de gagner de l'argent grâce aux programmes d'affiliation est qu'il existe essentiellement un risque ZÉRO pour vous ou pour l'entreprise pour laquelle vous souhaitez vendre. Vous n'êtes pas embauché comme salarié car vous conservez le statut de sous-traitant. Vous n'êtes pas obligé de faire quoi que ce soit et vous n'avez jamais à payer les produits à l'avance. Ils ne vous paient que si vous faites d'abord des bénéfices, c'est donc sans risque pour tout le monde. La seule chose que vous risquez est votre temps et vos efforts.

  • Très peu de capital de départ requis: Gagner de l'argent en utilisant les programmes partenaires est l'un des moyens les moins chers de gagner de l'argent en développant une entreprise légitime. La plupart des entreprises exigent que les gens prennent tout risque, y compris leur travail, leur maison, leurs économies, et peut-être devraient-ils même s'endetter pour commencer. La plupart des petites entreprises aiment profiter après 3 à 5 ans de dur labeur. Pour les commerçants connectés, les seuls coûts réels sont les coûts d'un domaine, d'un site Web et d'un hébergement. Vous pouvez toujours commencer pour moins de 100 $. Quelle autre entreprise peut vous offrir ce genre d'opportunité?

  • Pas de service client: C'est l'un de mes aspects préférés pour gagner de l'argent avec l'aide de programmes partenaires. Lorsque vous vendez le produit de service de quelqu'un d'autre, ILS offrent un service client, pas vous! L'un des aspects les plus stressants de la gestion d'une entreprise est de résoudre tous les problèmes mineurs qui surviennent, les clients insatisfaits, etc. Le marketing d'affiliation se chargera de tout cela.

  • Aucun traitement de paiement: Voulez-vous savoir quoi d'autre est ennuyeux? Entreprises de traitement des paiements. Vous n'avez jamais besoin de prendre un numéro de carte de crédit, d'accepter un paiement PayPal ou de gérer les virements bancaires en tant que distributeur affilié, à moins qu'une entreprise ne vous paie réellement des commissions. Tous les paiements effectués par les clients sont gérés par l'entreprise pour laquelle vous êtes partenaire. Encore un mal de tête auquel vous n'aurez plus jamais à faire face.

  • Aucun bureau ni employé à traiter: Un facteur de stress majeur pour de nombreux entrepreneurs est la gestion du personnel et la logistique de la gestion d'un bureau ou d'une installation fonctionnelle. Encore une fois, les commerçants affiliés n'ont pas à s'en soucier. La grande majorité des sociétés de marketing affiliées sont chassées de leur domicile par des entrepreneurs privés.

  • Polyvalence commerciale: Presque toutes les industries ont une très large gamme de produits qui peuvent être vendus s'ils concernent un créneau. Si vous commencez à promouvoir un produit, mais avec le temps, un autre produit devient la meilleure option à promouvoir, vous pouvez le changer à tout moment. Il n'y a aucune obligation de continuer à vendre l'un ou l'autre produit. Eh bien, vendez-les tous les deux si vous voulez! La plupart de mes sites gagnent de l'argent grâce aux programmes partenaires de plusieurs services différents. Notez également que j'ai de nombreux sites dans de nombreuses industries différentes, ce qui contribue à diversifier encore plus mon entreprise.

  • Revenu résiduel: Bien que je ne dirais pas que le marketing d'affiliation est complètement résiduel, il offre une source de revenus quelque peu passive. Cela signifie que le montant d'argent que je gagne n'est pas lié à mon temps. Je ne suis pas payé à l'heure, je suis payé à la vente, et parce que mes sites Web fonctionnent 24/7/365, je vends parfois des choses et gagne de l'argent grâce à des programmes partenaires pendant que je dors. Seulement & # 39; se réveiller le matin pour voir que je & # 39; gagner de l'argent du jour au lendemain est un sentiment qui ne vieillit jamais.

  • La liberté: De loin, ma part préférée de gagner de l'argent avec les programmes partenaires est la liberté que cela implique. Je peux travailler où je veux, quand je veux, avec qui je veux, aussi fort que je veux et j'appelle tous les plans. Je voyage aux États-Unis depuis 2009 et j'adore travailler partout.

Comment fonctionne le marketing d'affiliation

Comment fonctionne le marketing d'affiliation

Avant de pouvoir apprendre à gagner de l'argent en utilisant des programmes d'affiliation, vous devez au moins comprendre les bases du fonctionnement du marketing d'affiliation. Pour ce faire, je veux vous donner un exemple personnel que j'utilise sur ce site où vous vous trouvez actuellement.

L'une des façons dont je gagne de l'argent sur ce site Web est grâce à un partenariat partenaire que j'ai avec un service appelé Wealthy Affiliate. Pour ceux d'entre vous qui ne connaissent pas, Wealthy Affiliate est un service d'adhésion mensuel qui fournit une formation et des outils aux personnes qui veulent gagner leur vie grâce au marketing d'affiliation. Voilà comment cela fonctionne …

Wealthy Affiliate m'a donné un soi-disant "lien d'affiliation". Il s'agit d'un lien unique spécial que je peux utiliser pour suivre les personnes qui se réfèrent. Par exemple, si vous cliquez sur ce lien vers Wealthy Affiliate, le logiciel de suivi WA détectera que c'est moi qui vous ai référé. Vous pouvez alors remarquer que Wealthy Affiliate a l'air cool et que vous souhaitez vous inscrire à leur option d'adhésion gratuite pour essayer les choses. Dès que vous créez un compte, j'obtiens un crédit si vous passez éventuellement à un abonnement payant, ce qui signifie que je gagne une commission!

En bref, c'est ainsi que je gagne de l'argent avec l'aide de programmes partenaires sur ce site Web où vous vous trouvez. Regardez la vidéo ci-dessous pour plus d'explications sur le fonctionnement du marketing d'affiliation.

Comment je gagne de l'argent en utilisant des programmes d'affiliation pour tous mes sites

Je possède actuellement une dizaine de sites Internet et je grandis. Vous pouvez en voir un presque liste complète de ces sites sur la page principale de mon entreprise à RogersConcepts.com. Presque tous mes sites Web gagnent des revenus de la même manière. J'ai conçu des sites Web qui contiennent de nombreux contenus et articles utiles (comme cet article que vous lisez maintenant!). Ces articles finissent bien dans les moteurs de recherche. Cela signifie que j'obtiens des visiteurs sur mon site gratuitement et certaines de ces personnes cliquent sur mes liens d'affiliation.

Je jure qu'il n'y a pas de secret & # 39; spécial est pour mon entreprise et ce n'est vraiment pas si compliqué. Cependant, si vous souhaitez plus d'informations sur le processus spécifique que j'utilise pour créer chacun de mes sites, vous pouvez trouver plus d'informations ici sur le processus C–> T–> P–> M.

Vous guider à travers mon propre exemple personnel

Au lieu d'essayer de vous dire comment vous pouvez gagner de l'argent en utilisant des programmes d'affiliation, je veux vous montrer un exemple spécifique sur l'un de mes sites. Je possède le site Web DogFoodInsider.com et ce site me rapporte des milliers de dollars par mois avec le programme d'affiliation Amazon Associates. Ce que je voudrais faire maintenant, c'est montrer comment j'ai décidé de construire ce site, ma stratégie lors de sa création et comment il rapporte tant d'argent.


Étape 1 – Avant de commencer un nouveau site Web, je fais une liste de 3 sujets de niche parmi lesquels je peux choisir. Tous ces sujets de niche sont des sujets qui me passionnent ou dont je veux vraiment en savoir plus. Avec ces 3 idées de niche, j'effectue ce qu'on appelle la recherche de mots clés, afin de pouvoir faire une liste d'un minimum de 100 idées d'articles dans une feuille de calcul. Pour DogFoodInsider.com, j'ai en fait une liste avec plus de 500 idées d'articles.


Étape 2 – Une fois mon étude de marché terminée et j'ai eu ma liste d'articles pour mon nouveau site, j'ai enregistré le nom de domaine, mis en place l'hébergement Web et créé mon site WordPress.


Étape 3 – À ce stade, j'ai commencé à créer autant de contenu que possible. Cette étape a duré environ 6 mois et est toujours en cours près de 5 ans plus tard. Si vous utilisez les mêmes méthodes que moi, votre tâche la plus importante en tant que distributeur affilié produira du contenu. Le type de contenu le plus important sur lequel je me suis concentré était de rédiger des critiques de haute qualité afin que les propriétaires de chiens puissent déterminer le meilleur type de nourriture pour chien qu'ils pouvaient acheter pour leur chien.


Étape 4 – Après avoir écrit du nouveau contenu quotidien pour le site pendant environ 6 mois, je me suis inscrit pour devenir affilié au programme d'affiliation Amazon Associates. Une fois approuvé, j'ai commencé à implémenter les liens d'affiliation Amazon sur mon site. Beaucoup de ces liens ont été intégrés dans mes articles de revue d'articles pour chiens et finalement le site a commencé à faire un profit substantiel. Plus j'écris d'articles, plus ça fait!


Étape 5 – Une fois que le site a réalisé des bénéfices réguliers et peut gagner de l'argent grâce aux programmes d'affiliation, je commence à embaucher des rédacteurs indépendants sur des sites comme Upwork.com pour m'aider à produire encore plus de contenu. C'est ainsi que j'ai pu faire évoluer ce site à un niveau où il génère désormais des milliers de profits chaque mois.


Je me rends compte que cela semble beaucoup trop simple. Les gens vendent des cours de formation et des livres électroniques sur la façon de gagner de l'argent en utilisant des programmes d'affiliation, mais franchement, tout est duveteux. Le processus de gagner de l'argent en utilisant le marketing d'affiliation est en fait assez simple. Faites des études de marché, fournissez du contenu qui n'existe pas sur le Web (ou faites-le mieux), placez des liens d'affiliation sur votre site lorsque vous commencez à générer du trafic, puis profitez-en!

La partie la plus difficile du marketing d'affiliation

Le marketing d'affiliation n'est pas «difficile» dans le sens où il nécessite un spécialiste des fusées. De nos jours, tout le monde peut créer un site Web fantastique, vous n'avez pas besoin de connaître un code informatique et les obstacles techniques sont relativement faciles à surmonter. La chose la plus importante qui retient la plupart des nouveaux commerçants affiliés est l'incapacité à la maintenir suffisamment longtemps et à effectuer la tâche principale nécessaire pour vraiment réussir dans cette … Création de contenu.

La création d'un site Web prend au plus quelques jours. L'inscription au programme partenaire de & # 39; s prend littéralement quelques minutes. Mais créez-vous le contenu pour rendre votre site précieux? C'est une autre histoire.

La plupart des gens n'ont aucun problème pour commencer. «Bien sûr, je peux écrire un nouvel article sur mon site tous les jours! C'est simple! "Eh bien, c'est ce que la plupart des gens disent au début. Mais après quelques mois, les gens commencent à se détendre. Au lieu d'écrire un article tous les jours, ils en écrivent quelques-uns par semaine, puis peut-être quelques-uns tous les mois, puis rien.

Le dévouement de s'asseoir tous les jours et d'écrire du contenu n'est pas une réalisation facile. Cet article, par exemple, m'a pris des heures à créer et il fait plus de 2000 mots. Ce n'est même pas considéré comme un long article dans le monde du marketing d'affiliation.

Cela dit, tant que vous vous concentrez sur le fait de consacrer un peu de temps chaque jour à votre entreprise, vous continuerez toujours de terminer votre travail quotidien.

Évitez le bruit et préparez-vous au succès!

Le plus gros problème pour les nouveaux commerçants affiliés est simplement la surcharge d'informations. Mon site dit une chose, un autre commerçant affilié dit autre chose et un autre dit quelque chose de complètement différent. Il est vraiment difficile de trier les choses et de comprendre tout le bruit.

Ce dont vous avez vraiment besoin, c'est d'apprendre uniquement ce que vous devez savoir aux moments optimaux où vous devez les apprendre. Il est presque impossible de le régler vous-même, je conseille donc toujours aux gens d'obtenir de l'aide supplémentaire pour que les choses se déroulent mieux.

J'ai déjà indiqué que je suis un revendeur affilié pour le service Wealthy Affiliate, donc je suis quelque peu biaisé, mais l'une des raisons pour lesquelles j'aime Wealthy Affiliate est parce qu'elles aident à rendre les choses plus gérables pour les nouveaux affiliés. . Ils vous aident à montrer ce que vous devez savoir pour gagner de l'argent en utilisant des programmes d'affiliation, dans l'ordre que vous devez connaître, avec tous les outils dont vous aurez besoin pour bâtir votre entreprise en un seul endroit et pour un coût très raisonnable. Consultez-les et ouvrez un compte gratuit ici. Si vous ne les aimez pas, cela ne fera pas de mal. Sinon, passez à la version premium et préparez-vous à travailler!

Marre de gagner des clopinettes avec AdSense et les articles sponsorisés ? Vous voulez tenter l’affiliation, cependant vous ne savez pas quelle plateforme choisir pour gagner de vrais recette sur Internet ? Quand débute une aventure de web entrepreneur, plateformes d’affiliation sont les plus puissants endroits pour trouver des articles à vendre et se créer un revenu régulier et quelquefois récurrent… Le problème, c’est que plus de 75% des débutants (selon blogueurs anglais) ne savent franchement pas comment fonctionnent les plateformes d’affiliation et se plantent dans envie de gagner de l’argent sur Internet. Mais aujourd’hui plus que jamais, il est possible de se perpétrer légèrement de sous, soit pour arrondir ses issue de mois, soit pour en instituer une source de produit stable et en en vendant les articles des autres sur Internet.

Comment lancer avec succès une entreprise de dropshipping à l'aide de publicités Facebook – Dropshipping tutoriel

Pas seulement dans le secteur du drop shipping; que ce soit la livraison à domicile au-dessus du go-n-bye ou la réservation en ligne de billets de cinéma via la caisse enregistreuse; nous aimons toujours quand nos mains et nos bras sont au repos. C'est précisément ce que la fonctionnalité la plus avantageuse de Facebook Advertising est pour les entreprises Dropshipping prospères.

Facebook est la plate-forme idéale pour présenter vos produits vendables à 1,23 milliard d'utilisateurs actifs par mois qui sont déjà sur Facebook. Ils visualisent, aiment et enfin cliquent sur le lien de votre site, sans effort supplémentaire, tout en traquant le meilleur ami de leur ex, même à leur insu!

Viola! Que pouvez-vous demander d'autre?

Commencez avec les publicités Facebook dans votre entreprise Dropshipping

Si vous en savez assez sur le marketing en ligne, vous savez que le classement en SEO est quelque chose qui prend du temps. Les publicités Facebook peuvent vous aider à démarrer vos ventes à mesure que votre jeu SEO se développe.

Lorsque vous commercialisez votre société de livraison directe pour AliExpress, votre objectif est assez clair: générer de plus en plus de trafic vers votre page et maximiser le nombre de produits vendus. Dès que le but de votre annonce est clair, Facebook remporte à nouveau la course.

Contrairement à d'autres sites de médias sociaux, vous pouvez publier vos messages sponsorisés et promotionnels avec Facebook, ainsi que d'autres flux d'actualités réguliers et également sous forme d'annonces sponsorisées distinctes.

Alors que se passe-t-il réellement ici?

Même lorsque vous générez une annonce payante pour votre site parce que l'annonce apparaît avec la colonne de flux d'actualités régulière, les utilisateurs ne griffonnent pas la souris en soupçonnant certaines listes de produits promotionnels, mais cela les intéresse comme les autres publications régulières avec des commentaires réguliers, comme et partager des options. Et Facebook affiche intelligemment le nombre total de réponses à la publication au lieu du seul nombre de réponses à la dernière version partagée que les utilisateurs consultent.

Vous savez, la première impression est importante.

Structure des publicités Facebook: vous aide à mieux comprendre les publicités Facebook

Les publicités Facebook d'une entreprise de livraison directe réussie sont structurées en trois phases décroissantes:

  1. Campagnes (détermine résolument l'objectif publicitaire)
  2. Ensembles de créations (publicités classées en fonction du public cible et de votre budget)
  3. Publicités (publicités réelles montrées aux utilisateurs)

Campagne

La phase & # 39; Campagne & # 39; commence là où vous devez définir les objectifs principaux de votre annonce. Supposons que vous ayez deux types de jeux d'annonces pour votre site Web de dropshipping; l'un appartient à l'ensemble du site Web et les autres ensembles de publicités concernent des produits spécifiques.

Vous avez certains objectifs pour les deux ensembles d'annonces. Avec le premier type d'annonces que vous souhaitez:
  • Maximisez le trafic vers votre site dropshipping
  • Obtenez plus de likes
  • Augmentez le groupe cible de votre compagnie de livraison directe
  • Coin quelques offres
  • Accroître la notoriété de la marque
  • Alors que vous souhaitez maximiser les ventes indépendantes de ces produits avec les publicités des autres produits spécifiés.

À ce stade, vous devez soigneusement classer chaque annonce en fonction de son adjectif respectif et créer la "campagne" appropriée pour chacune des catégories.

Ensembles créatifs

Au stade & # 39; Ensembles d'annonces & # 39; Souhaitez-vous proposer les publicités aux groupes cibles concernés en fonction de leurs caractéristiques démographiques, de leurs intérêts, de leur occupation, des groupes Facebook auxquels ils appartiennent, des types de messages qu'ils préfèrent, des pages auxquelles vous avez répondu, des événements de la vie récents, de la fréquence d'achat et intérêt personnel.

"Facebook Audience Insights" est un outil gratuit de Facebook qui fait de l'ensemble du processus de tri un jeu d'enfant. Il suffit de l'utiliser, je ne l'appelle même pas & quot; outil gratuit & quot;, cela fait partie des publicités FB que vous DEVEZ utiliser.

Par exemple, si vous vendez des accessoires de sport, vous fournissez un ensemble d'annonces à votre & # 39; audience personnalisée & # 39 ;; un autre ensemble pour les personnes avec un séjour plus proche; un autre pour les personnes ayant au moins une personne et sa liste d'amis qui ont acheté via votre site.

publicités

La phase finale, les "publicités", est la combinaison la plus étroite et la plus pertinente des objectifs et des groupes cibles les plus utiles. Voici la partie pour créer des publicités en direct. Pour chacun des ensembles d'annonces, vous devez combiner plusieurs logos, descriptions et images pour trouver celui qui fonctionne le mieux.

N'oubliez pas d'effectuer des tests A / B. Un simple changement de couleur peut augmenter le taux de conversion de 100%.

Concentré sur le bon groupe cible

Pourquoi traiter Cendrillon avec une moustache arc-en-ciel? Wink Wink!

Des études ont montré que seul le fait de ne pas cibler le bon public a conduit de nombreuses entreprises de dropshipping vers les chiens, tandis que l'inverse peut prétendre à un succès retentissant. Si vous avez correctement étudié votre créneau de livraison directe, c'est la partie la plus simple.

Démographie, intérêt et profession

Il est clair qu'un ancien militaire de 60 ans n'aimera pas les mêmes produits sur votre site Web qu'une lycéenne. Avec & # 39; Facebook Audience Insight & # 39;, une extension intégrée de Facebook, vous pouvez distinguer votre audience cible réelle par:

  • Âge
  • Occupation
  • Loisirs & # 39; s
  • Intérêts (groupes Facebook auxquels ils appartiennent, types de messages qu'ils aiment le plus, pages auxquelles ils ont répondu.)
  • Événements de la vie récents
  • Fréquence d'achat

Si vous vendez des appareils de cuisine, Facebook ciblera automatiquement uniquement les personnes de votre entourage qui ont récemment acheté des appareils de cuisine ou des articles associés ou qui ont manifesté leur intérêt pour cela ou qui appartiennent au moins à un groupe d'intérêt particulier.

En bref, vous pouvez rayonner au laser vos clients potentiels. C'est exactement ce dont nous avons besoin dans une boutique de niche dropshipping!

Géographie

Plus votre cercle est concentré, plus il est proche du succès. La première chose à aborder dans les publicités Facebook pour les entreprises Dropshipping prospères est l'emplacement. En tant que détaillant du pôle Sud, rendre la vente de vestes coupe-vent à l'ours polaire du Nord un peu trop aventureux? Concentrez-vous sur vos acheteurs potentiels dans une zone géographique spécifique où vous pensez pouvoir livrer des produits au plus tôt.

Groupes cibles personnalisés

En plus de diffuser vos annonces auprès des groupes cibles, avec des outils de marketing Facebook avancés, vous pouvez personnaliser la liste de vos propres téléspectateurs préférés avec leurs adresses e-mail. Ils peuvent provenir de vos clients précédents, de critiques positives ou de personnes qui vous ont contacté personnellement pour un produit spécifique.

Le facteur budgétaire

L'argent compte. Je le suis vraiment.

Un cent vaut la peine d'être gaspillé à tout prix, surtout si vous êtes un entrepreneur en drop shipping. Nous vous recommandons toujours d'aller lentement. Au lieu d'investir une énorme somme d'argent dans une seule campagne publicitaire, vous investissez d'abord un montant inférieur.

Suivez la croissance et grandissez en conséquence. Avec "Facebook Advertising Tool", vous pouvez payer les publicités quotidiennement et également comme un investissement ponctuel ou le "budget à vie" comme ils l'appellent.

N'oubliez PAS de tester de nouvelles choses. Vous perdez de l'argent, mais seulement pour gagner beaucoup plus que ce que vous perdez. Apprenez simplement les leçons et rappelez-vous, tout ce que vous avez à faire est de marketing, vous ne gérez pas correctement votre inventaire, emballage et expédition et vous investissez beaucoup d'argent. Allez dehors et essayez de nouvelles choses et ne vous cassez pas si vous perdez de l'argent.

Bien qu'un budget quotidien soit beaucoup plus faible à la fois pour des raisons évidentes, nous vous recommandons personnellement de choisir le «Budget à vie» jusqu'à ce que vous maîtrisiez le facteur d'investissement. Avec un budget quotidien, vous avez certaines chances de dépasser votre budget total, tandis que la définition du "budget à vie" unique réduit les chances.

Nous vous recommandons de choisir le "Budget à vie" et de spécifier la durée pendant laquelle Facebook doit dépenser tout votre argent pour vos annonces.

Facebook dépense l'argent budgété de deux manières: en fonction des clics (CPC) ou des impressions (CPM). avec CPC (coût par clic) Facebook génère automatiquement les annonces en votre nom pour les utilisateurs les plus pertinents et avec CPM (coût pour 1000 impressions), l'argent est déduit pour chaque 1000 impressions de votre annonce.

Avec "l'outil publicitaire Facebook" automatisé, vous pouvez annoncer chaque coupon de réduction ou offrir séparément si vous le souhaitez.

Placement d'annonces Facebook pour les entreprises de dropshipping

Vous disposez de 5 options pour placer votre annonce sur le tableau d'affichage de Facebook au fur et à mesure:

  1. Flux d'actualités sur le bureau
  2. Flux d'actualités mobile
  3. Instagram
  4. Réseau public
  5. Colonne de droite sur le bureau

Les statistiques indiquent que les deux premières options, à savoir le flux d'actualités pour ordinateur et le flux d'actualités pour mobile, génèrent un trafic maximal. Évitez facilement la colonne de droite du bureau.

Comment commercialiser avec succès une entreprise Dropshipping avec des publicités Facebook: résumé

J'espère que ce post vous a été utile. Nous voulons que tous nos clients et personnes qui souhaitent former aspi pour devenir des dropshippers réussis avec nos tutoriels spécifiques pour augmenter vos ventes et augmenter vos revenus d'entreprise.

Aimez-nous si le message vous a été utile et partagez vos questions dans les commentaires ci-dessous.

Dropshipping heureux!



Comment gagner de l'argent en ligne à l'aide de ventes, de produits ou de publicités connectés – Tout sur l’Affiliation

Apprendre à gagner de l'argent en ligne n'est pas aussi difficile que prévu. Voyons les options les plus importantes.

Comment gagner de l'argent en ligne avec des publicités

La façon la plus courante pour les gens de gagner de l'argent avec un blog ou un site Web est par le biais de publicités. Je ne le recommande pas sauf si vous avez beaucoup de trafic. Pourquoi? Les pourcentages publicitaires sont médiocres, vous avez donc besoin de beaucoup de visiteurs pour générer des revenus importants.

Si vous n'avez pas un grand nombre de visiteurs, les annonces ralentiront votre site Web, ennuieront vos lecteurs et ne généreront pas de revenus.

Si vous avez un grand nombre de visiteurs, il existe de meilleures façons de gagner de l'argent qui ne ruinera pas votre beau blog rapide (n'avez-vous pas un blog rapide?)

Quelles sont donc les meilleures options?

Ventes aux affiliés

Votre première bonne option est le revenu d'affiliation. Cela signifie uniquement que vous êtes payé par d'autres sociétés pour référer les ventes à leurs produits.

Bluehost en est un exemple bien connu, que vous trouverez probablement recommandé sur de nombreux blogs & # 39; ont vu. Pourquoi les gens veulent-ils tellement pousser Bluehost alors qu'il y a tant de grands hôtes WordPress rapides? Simple, ils paient 80 $ + pour chaque client qui envoie quelqu'un le chemin. Combien d'annonces Google sans valeur devez-vous afficher pour gagner 80 $? Beaucoup!

Quel que soit le marché ou le créneau dans lequel vous vous trouvez, il existe des programmes partenaires que vous pouvez promouvoir. Trouvez des choses que vous utiliseriez vraiment (promouvoir des choses que vous ne soutenez pas est un mauvais moyen de gagner la confiance), puis faites-en la promotion sur votre blog et dans vos e-mails.

Comment trouver des programmes partenaires à promouvoir

Le moyen le plus simple si vous connaissez un produit spécifique que vous souhaitez promouvoir est simplement google "calendrier d'affiliation de produit". S'ils en ont un, c'est au sommet. Il vous suffit de vous inscrire et de récupérer votre lien personnalisé.

Si vous manquez d'idées, consultez ShareASale, une plateforme pour trouver des liens d'affiliation à promouvoir sur votre blog. Ils répartissent tous les programmes disponibles par catégorie afin que vous puissiez trouver les programmes qui vous conviennent. J'utilise ShareASale pour quelques produits différents (et ce lien lui-même est même un lien d'affiliation – voyez comment cela fonctionne ..?)

En insérant les liens d'affiliation dans vos e-mails et entonnoirs de messagerie, vous devez être en mesure d'envoyer des produits pertinents à vos lecteurs, exactement quand ils sont intéressés. C'est un moyen de gagner sérieusement de l'argent et cela en vaut la peine à 100% pour bien comprendre.

Vos propres produits

Ces dernières années, j'ai vendu des centaines de milliers de dollars de mes propres produits. Cela prend un peu plus d'investissement et un peu plus de temps, mais cela peut entraîner un énorme gain!

Si vous êtes passionné par quelque chose, je crois que la construction de vos propres produits est le moyen de générer des revenus sérieux et de construire quelque chose de durable. Vous ne dépendez pas d'autres personnes qui construisent des choses que vous pouvez vendre.

Voici quelques idées d'articles qui ont tendance à bien fonctionner et que vous pourriez fabriquer et vendre:

  • eBooks
  • De vrais livres, en utilisant une imprimante à la demande ou en imprimant vous-même une charge
  • Bijoux non antérieurs (bracelets, montres, colliers)
  • Maroquinerie (portefeuilles, sacs à main, sacs)
  • Produits EDC (sacs, couteaux, stylos, bloc-notes)

Tous ces articles peuvent être fabriqués à bas prix dans des pays à faible coût de vie, comme la Chine ou l'Inde, puis vendus en ligne pour un bon profit.

Le problème le plus courant n'est pas de trouver une idée, mais de financer la production. J'ai eu ce problème mais j'ai vendu 30 000 $ de mon premier produit en 30 jours. Comment? Crowdfunding sur Kickstarter.

Je sais que le financement participatif ressemble à un marché vraiment concurrentiel, mais franchement, ce n'est pas difficile à faire, tant que vous le faites bien. J'ai écrit une section entière sur la conduite d'une campagne de financement participatif et je suis toujours convaincu que c'est la voie vers un revenu en ligne important. Si je commençais aujourd'hui, je continuerais toujours une campagne Kickstarter.